郭飛虎，陳玉清，劉 婷，陳寶軍，梁積新，徐 琪，邱 芊，陳大明，杜 進(jìn)

1.中國(guó)原子能科學(xué)研究院 同位素研究所，北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413；3.環(huán)境保護(hù)部 核與輻射安全中心 政策法規(guī)研究所，北京 100082；4.杭州中肽生化有限公司，浙江 杭州 310018；5.中國(guó)同輻股份有限公司，北京 100045

生長(zhǎng)抑素(somatostatin，SST)是一種含有14或28個(gè)氨基酸的天然多肽類(lèi)激素，廣泛分布于人體中樞內(nèi)分泌系統(tǒng)和許多腦外組織，對(duì)垂體、胰腺和胃腸組織的各種分泌過(guò)程有抑制作用，通過(guò)與存在于細(xì)胞組織上的受體特異性結(jié)合發(fā)揮作用[1]。由于生長(zhǎng)抑素在體內(nèi)的生物半衰期非常短(約3 min)，從而限制了它在臨床的應(yīng)用[2]。奧曲肽是一種人工合成的生長(zhǎng)抑素類(lèi)似物，含有8個(gè)氨基酸，其性質(zhì)與SST相似，與SSTR2、SSTR5亞型保持高親和力，但其結(jié)構(gòu)中引入了D-型氨基酸，增強(qiáng)了抗酶降解的能力，體內(nèi)半衰期約為2 h[3]。研究發(fā)現(xiàn)在奧曲肽的結(jié)構(gòu)中引入糖基，可優(yōu)化其體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)特性，降低小分子多肽的親脂性和肝膽代謝程度，增加腎臟排泄[4-7]。而腫瘤細(xì)胞組織上常有一些生長(zhǎng)抑素受體(SSTR)的過(guò)表達(dá)。因此，可用放射性核素標(biāo)記奧曲肽及其衍生物對(duì)SSTR陽(yáng)性腫瘤進(jìn)行診斷和治療[8-9]。

早在20世紀(jì)80年代晚期，人們已經(jīng)對(duì)生長(zhǎng)抑素受體顯像進(jìn)行了深入研究[4]。在放射性核素標(biāo)記的生長(zhǎng)抑素類(lèi)似物中，111In-DTPA-Octreotide 作為世界上第一個(gè)獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)的多肽類(lèi)放射性藥物，已在臨床上廣泛用于生長(zhǎng)抑素受體陽(yáng)性腫瘤的診斷[10]，[123I]-Tyr3-octreotide已經(jīng)用作臨床研究[11]，[99Tcm]depreotide也已被批準(zhǔn)用于肺癌的評(píng)估[4]。與SPECT相比，PET顯像有更好的優(yōu)越性，如更高的靈敏度和空間分辨率，能夠?qū)ι锓植己痛x過(guò)程進(jìn)行定量研究，所以對(duì)正電子核素標(biāo)記的生長(zhǎng)抑素類(lèi)似物的研究也越來(lái)越多。18F半衰期為109.6 min，和奧曲肽的體內(nèi)生物半衰期相匹配，β+能量較低(0.635 MeV)，是一個(gè)臨床應(yīng)用最廣泛、核素性質(zhì)非常理想的正電子核素。18F標(biāo)記的糖基化奧曲肽衍生物[18F]FP-Gluc-TOCA已經(jīng)用作臨床研究，顯像效率明顯優(yōu)于[111In]DTPA-octreotide。但是由于其放化合成過(guò)程繁瑣，合成時(shí)間長(zhǎng)，放化產(chǎn)率低(衰變校正后僅為25%～35%)，這在很大程度上影響臨床使用[4-5]。

McBride等[12-13]研究了一種通過(guò)Al18F復(fù)合物和偶聯(lián)1,4,7-三氮環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid，NOTA)或其衍生物的多肽通過(guò)螯合反應(yīng)制備18F標(biāo)記正電子藥物的方法，方法新穎，合成過(guò)程簡(jiǎn)單，尤其是在標(biāo)記過(guò)程中免去了通常采用的需要嚴(yán)格控制無(wú)水條件的親核取代反應(yīng)。穩(wěn)定性試驗(yàn)研究表明，[Al18F]NOTA在體內(nèi)外都非常穩(wěn)定，適合用作臨床研究。D’Souza[14]和Shetty等[15]用X射線晶體衍射對(duì)[Al19F]NOTA的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示其空間結(jié)構(gòu)為扭曲的八面體，鋁原子在八面體中心。

2010年Laverman等[16]通過(guò)該法制備了[Al18F]NOTA-octreotide。它的小動(dòng)物PET/CT顯像顯示，腫瘤的輪廓清晰可見(jiàn)，在骨中的攝取很低。該法目前也有用作18F標(biāo)記蛋白[17]、RGD[18-19]及其它多肽[14-15，20-22]研究的報(bào)道。

本工作擬在上述研究的基礎(chǔ)上以Fmoc保護(hù)的氨基酸、n-Gluc-Lys(Fmoc)-OH、Bis(tBu)NOTA和苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate，HBTU)等為原料設(shè)計(jì)合成偶聯(lián)雙功能螯合劑NOTA的糖基化奧曲肽衍生物n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA，再用Al18F標(biāo)記，并測(cè)定標(biāo)記物體外穩(wěn)定性、水溶性及正常鼠體內(nèi)分布情況，以為進(jìn)一步研究Al18F復(fù)合物標(biāo)記的奧曲肽衍生物作為生長(zhǎng)抑素受體陽(yáng)性腫瘤顯像劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.1 儀器和材料

ECLIPSE HP型回旋加速器(11 MeV)，德國(guó)西門(mén)子公司；CRC?-15PET放射性活度計(jì)，美國(guó)Capintec公司；ESI-MS質(zhì)譜儀，美國(guó)ThermoFinnigan公司；高效液相Agilent 1100(多肽分析)，美國(guó)安捷倫公司；高效液相Waters 4000(多肽制備)，美國(guó)Waters公司；高效液相系統(tǒng)ProStar 320系統(tǒng)(標(biāo)記),美國(guó)Varian 公司；GABI型高效液相色譜放射性檢測(cè)儀，德國(guó)Raytest公司；Hypersil SDS2依利特色譜柱，5 μm,250 mm×4.6 mm,大連依利特分析儀器有限公司；多用恒溫箱，天津奧特賽斯儀器有限公司；MILLIPORE水凈化系統(tǒng)，法國(guó)Millipore S.A.公司；Oasis? HLB 1cc(30 mg)萃取柱、Sep Pak light QMA柱，美國(guó)Waters公司；液相分析條件：流動(dòng)相A—水(含0.1%三氟乙酸(TFA))，流動(dòng)相B—乙腈(含0.1%三氟乙酸);流速:1.0 mL/min;0 min,95%A;5 min,95%A;8 min,15%A;18 min,15%A;20 min,95%A；紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)220 nm。

芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-蘇氨酸-樹(shù)脂(Fmoc-Thr(t-Bu)-Resin)、芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(Fmoc-Cys(Trt)-OH)、芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-蘇氨酸(Fmoc-Thr(t-Bu)-OH)、N-芴甲氧羰基-N′-叔丁氧羰基-L-賴(lài)氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)、N-芴甲氧羰基-N′-叔丁氧羰基-L-色氨酸(Fmoc-DTrp-(Boc)-OH)、芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-酪氨酸(Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH)、N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸(Fmoc-DPhe-OH)、N-鏈?zhǔn)狡咸烟?N′-芴甲氧羰基-L-賴(lài)氨酸(n-Gluc-Lys(Fmoc)-OH)、HBTU、N-甲基嗎啉(N-methylmorpholine，NMM)、二異丙基碳化二亞胺(1,3-diisopropylcarbodiimide，DIC)，純度99%，杭州中肽生化有限公司；1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸二叔丁酯(bis-tert-butyl-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid，bis-t-Bu-NOTA)，純度95%，法國(guó)CheMatech公司；冰醋酸，純度99.99%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；六水合三氯化鋁，光譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；H218O，純度98%，常熟華益化工有限公司；乙腈，色譜純，德國(guó)Merck公司；三氟乙酸，色譜純，百靈威科技有限公司；L-(+)-抗壞血酸鈉(分析純)、鄰苯二甲酸氫鉀(KHP)(優(yōu)級(jí)純)、無(wú)水乙酸鈉(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。除特別說(shuō)明外，所有的商品化試劑使用前均未進(jìn)一步純化處理。雄性昆明小鼠，4～6周齡(約20 g)，北京華阜康生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1多肽的結(jié)構(gòu) 擬合成多肽的結(jié)構(gòu)示于圖1。

圖1 n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2.2n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA的合成 n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA的合成路線示于圖2。在多肽反應(yīng)器中加入260 mg Fmoc-Thr(tBu)-樹(shù)脂(1)和20%哌啶，常溫下反應(yīng)30 min脫去Fmoc，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次，然后加入174 mg Fmoc-Cys(Trt)-OH、864 mg HBTU、532 μL NMM 在DMF 中反應(yīng)50 min，茚三酮檢測(cè)為陰性，過(guò)濾洗滌得到Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Resin,重復(fù)上述操作依次加入相應(yīng)的氨基酸：120 mg Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、140 mg Fmoc-Lys(Boc)-OH、168 mg Fmoc-DTrp(Boc)-OH、69 mg Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH、174 mg Fmoc-Cys(Trt)-OH、116 mg Fmoc-DPhe-OH、74 mg n-Gluc-Lys(Fmoc)-OH，最終得到n-Gluc-Lys(Fmoc)-Dphe-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-DTrp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹(shù)脂(2)。加入20%哌啶常溫下反應(yīng)30 min脫去Fmoc，用DMF洗滌3 次，然后加入42 mg Bis-t-Bu-NOTA、16 μL DIC、864 mg HOBt、532 μL NMM在DMF中反應(yīng)8 h，用DMF洗滌后干燥得到肽樹(shù)脂n-Gluc-Lys(Bis-t-Bu-NOTA)-DPhe-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-DTrp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tbu)-樹(shù)脂(3)，然后在三氟乙酸中酸解2次，每次2 h，過(guò)濾，濾液用乙醚沉淀后離心，并用乙醚洗滌2次得到粗品：n-Gluc-Lys(NOTA)-DPhe-Cys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr(4)。粗品用乙腈和水溶解，用I2氧化后用高效液相(HPLC)純化，凍干后得到n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA，最后用質(zhì)譜定性分析，用HPLC定量分析。

1.2.3n-Gluc-Lys([Al19F]NOTA)-TOCA的制備 向1.5 mL EP管中加入30 μL 2 mmol/L AlCl3的0.1 mol/L pH=4.0 的醋酸鈉緩沖液，10 μL 65 mmol/L KF的0.1 mol/L pH=4.0醋酸鈉緩沖液，20 μL 2.0 g/L的n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA的去離子水溶液。混合物搖勻后在105 ℃反應(yīng)20 min，冷卻至常溫，用HPLC純化后用質(zhì)譜進(jìn)行定性分析。

1.2.4n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA的制備 n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA的合成路線示于圖3。

(1)18F-生理鹽水溶液的制備

在回旋加速器上用核反應(yīng)18O(p,n)18F制得[18F]F-，然后富集在Sep-Park light QMA 柱上(QMA柱分別用10 mL 0.5 mol/L pH=8.4 NaOAc溶液和10 mL 去離子水淋洗)，用5 mL去離子水淋洗以除去吸附在QMA柱上的金屬雜質(zhì)離子，用0.2～1 mL生理鹽水洗脫得到生理鹽水溶液。

(2)AlCl3用量對(duì)標(biāo)記率的影響

向5個(gè)1.5 mL EP管中分別加入10 μL 2.0 g/L n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA的去離子水溶液，10 μL 10 g/L抗壞血酸的0.122 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀(KHP)溶液，100 μL 37～74 MBq18F-的生理鹽水溶液，用0.1 mol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0，再依次加入3 μL 0.5、1、2、3、4 mmol/L AlCl3的去離子水溶液?；旌衔飺u勻后在105 ℃反應(yīng)20 min，冷卻至常溫，用1 mL去離子水稀釋?zhuān)∑渲?0 μL用HPLC測(cè)定其標(biāo)記率。

(3)pH值對(duì)標(biāo)記率的影響

向5個(gè)1.5 mL EP管中分別加入3 μL 1 mmol/L AlCl3的去離子水溶液，10 μL 2.0 g/L n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA的去離子水溶液，10 μL 10 g/L抗壞血酸的0.122 mol/L KHP溶液，100 μL 37～74 MBq18F-的生理鹽水溶液，用1 mol/L或0.1 mol/L的稀HCl將pH調(diào)至3.00、3.50、3.83、4.00、4.32和4.88?；旌衔飺u勻后在105 ℃反應(yīng)20 min，冷卻至常溫。用1 mL去離子水稀釋?zhuān)∑渲?0 μL用HPLC測(cè)定其標(biāo)記率。

圖2 n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA的合成路線

Fig.2 Synthesis of n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA

圖3 n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA的合成路線

(4)不同緩沖體系對(duì)標(biāo)記率的影響

取3個(gè)反應(yīng)管分別編號(hào)①②③，① 號(hào)管中加入3.0 μL 1 mmol/L AlCl3pH=4的0.1 mol/L醋酸鈉溶液，10.0 μL 2.0 g/L n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA的0.5 mol/L醋酸鈉溶液，10 μL 10 g/L抗壞血酸的0.122 mol/L KHP溶液，100 μL 37～74 MBq18F-的生理鹽水溶液，用1.0 mol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0；② 號(hào)管加入3.0 μL 1 mmol/L AlCl3去離子水溶液，10.0 μL 2.0 g/L n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA的去離子水溶液，10 μL 10 g/L抗壞血酸的0.122 mol/L KHP溶液，100 μL 37～74 MBq18F-的生理鹽水溶液，用0.1 mol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0；③ 號(hào)管加入3.0 μL 0.5 mol/L AlCl3pH=4的0.1 mol/L醋酸鈉溶液，10.0 μL 2.0 g/L n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA pH=4的0.5 mol/L的醋酸鈉溶液，100 μL約37 MBq pH=4的[18F]F-的醋酸鉀溶液。分別搖勻后在105 ℃反應(yīng)20 min，冷卻至常溫，用1 mL去離子水稀釋?zhuān)∑渲?0 μL用HPLC測(cè)定其標(biāo)記率。

(5)乙醇對(duì)標(biāo)記率的影響

向反應(yīng)管中加入10 μL 2.0 g/L n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA的去離子水溶液，3 μL 1 mmol/L AlCl3的去離子水溶液，10 μL 10 g/L抗壞血酸的0.122 mol/L KHP溶液，100 μL 37～74 MBq18F-的生理鹽水溶液，用0.1 mol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0，最后分別加入100、500 μL乙醇。搖勻后在105 ℃反應(yīng)20 min，冷卻至常溫。用1 mL去離子水稀釋?zhuān)∑渲?0 μL用HPLC測(cè)定其標(biāo)記率。

(6)產(chǎn)品純化和質(zhì)量控制

將以上反應(yīng)液緩慢注入事先活化過(guò)的HLB柱，再用2 mL蒸餾水淋洗除去水溶性雜質(zhì)，吹干后用500 μL 75%(體積比，下同)的乙醇淋洗，淋洗液用生理鹽水稀釋至乙醇含量小于10%，用HPLC測(cè)定其保留時(shí)間和放化純，觀察其外觀性狀是否為無(wú)色澄清透明液體，用精密pH試紙測(cè)定其pH值。

1.2.5脂水分配系數(shù)的測(cè)定 取5 μL約24 000 s-1的n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA的生理鹽水溶液分別加入3個(gè)含有0.5 mL正辛醇和0.5 mL磷酸緩沖液(PBS)的1.5 mL EP管中，密封后在室溫下渦旋2 min，3 500 r/min條件下離心5 min。用移液器依次取出有機(jī)相和水相各200 μL置于γ計(jì)數(shù)管中，用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定計(jì)數(shù)。由公式lgP=lg(有機(jī)相計(jì)數(shù)/水相計(jì)數(shù))計(jì)算標(biāo)記物的平均lgP值。

1.2.6體外穩(wěn)定性研究 取20 μL約3.7 MBq的n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA生理鹽水溶液，分別置于3個(gè)1 mL磷酸緩沖液(pH=7.24,0.02 mol/L)和小牛血清中，置于37 ℃下，孵育30、60、120 min后，用HPLC測(cè)定其放射化學(xué)純度，觀察其體外穩(wěn)定性。

1.2.7正常小鼠體內(nèi)分布 取15只正常小鼠，分為3組，每組5只，經(jīng)尾靜脈注射100 μL約550 kBq的n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA注射液，分別于注射后30、60、120 min時(shí)處死，取心、肝、脾、胰腺、肺、腎、胃、腸、肌肉、骨頭、血、甲狀腺等相應(yīng)器官置于事先稱(chēng)量好的計(jì)數(shù)管底部，稱(chēng)重，測(cè)量計(jì)數(shù)。測(cè)量計(jì)數(shù)經(jīng)衰變校正后計(jì)算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA的鑒定

該化合物是在奧曲肽衍生物TOCA的基礎(chǔ)上通過(guò)三功能連接體Lys偶聯(lián)了鏈狀葡萄糖基和NOTA。合成方法是先將葡萄糖基和NOTA引入肽鏈，再?gòu)臉?shù)脂上酸解后氧化關(guān)環(huán)，最終制備了18 mg n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA，收率為11%。通過(guò)質(zhì)譜分析可知m/z為814.2[(M+2H)/2],與計(jì)算值相符(C73H107N15O23S2，M計(jì)算=1 626.9)，通過(guò)HPLC分析可知其純度大于95.0%，保留時(shí)間為11.876 min，結(jié)果示于圖4(a)。該方法避免了用市場(chǎng)現(xiàn)有的奧曲肽連接糖基和NOTA時(shí)副反應(yīng)多、收率過(guò)低甚至得不到最終產(chǎn)品的問(wèn)題[23]。

圖4 n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA(a)和n-Gluc-Lys([Al19F]NOTA)-TOCA(b)HPLC分析圖譜

2.2 n-Gluc-Lys([Al19F]NOTA)-TOCA的分析

用HPLC純化后的化合物通過(guò)質(zhì)譜分析可知m/z為836.6[(M+2H)/2],與計(jì)算值相符(C73H107Al19FN15O23S2，M計(jì)算=1 671.7)。HPLC分析圖譜示于圖4(b)，保留時(shí)間為11.697 min。

2.3 n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA的合成

(1)18F-的生理鹽水溶液

18F-通常是吸附在QMA柱上后用碳酸氫鉀等堿性溶液淋洗，由于本實(shí)驗(yàn)中pH是影響標(biāo)記率的關(guān)鍵因素，需要用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.0，這會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過(guò)程相對(duì)繁瑣，帶來(lái)較大誤差。該法先將18F-富集在用10 mL 0.5 mol/L pH=8.4 NaOAc溶液和10 mL去離子水活化過(guò)的QMA柱上，再用生理鹽水洗脫，結(jié)果顯示0.2 mL生理鹽水能洗脫約80%的18F-。

(2)AlCl3的用量

AlCl3用量對(duì)標(biāo)記率的影響結(jié)果示于圖5。由圖5可知，當(dāng)加入AlCl3的濃度為1 mmol/L，反應(yīng)體系中AlCl3的濃度為48 μmol/L(n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA和AlCl3的物質(zhì)的量之比為4.1∶1)時(shí)，標(biāo)記率達(dá)最大值69%?？赡艿脑蚴牵篈lCl3的加入量不足時(shí)，Al18F的濃度過(guò)低，標(biāo)記率降低；當(dāng)AlCl3過(guò)量時(shí)，因?yàn)锳l3+與NOTA能形成穩(wěn)定絡(luò)合物[24-25]，所以主要是Al3+與Al18F競(jìng)爭(zhēng)螯合，導(dǎo)致標(biāo)記率降低。

圖5 AlCl3濃度對(duì)標(biāo)記率(Y)的影響

圖6 pH值對(duì)標(biāo)記率(Y)的影響

(3)反應(yīng)體系的pH值

其它條件保持不變的情況下，pH值對(duì)標(biāo)記率的影響結(jié)果示于圖6。由圖6可知：pH值是影響標(biāo)記率的關(guān)鍵因素，pH=4.00時(shí)標(biāo)記率達(dá)最大值69%，這是因?yàn)閜H<4時(shí)，18F-質(zhì)子化為HF，pH值越小，18F-質(zhì)子化程度越高，反應(yīng)體系中游離的18F-濃度越低，標(biāo)記率越低；當(dāng)pH>5時(shí)，Al3+開(kāi)始水解，溶液中游離Al3+的濃度減小，pH值越大，其水解程度越大，體系中Al3+的濃度越小，標(biāo)記率越低。由文獻(xiàn)[26]計(jì)算可知，當(dāng)pH=4.00時(shí)，AlF2+的條件形成常數(shù)lgK達(dá)最大值6.04。這和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

(4)不同緩沖體系的選擇

其它條件保持不變的情況下，比較了KHP和醋酸鈉混合緩沖體系、KHP緩沖體系、醋酸鈉緩沖體系對(duì)標(biāo)記率的影響。緩沖體系①(9.76 mmol/L KHP和42.4 mmol/L醋酸鈉)的標(biāo)記率為64%；緩沖體系②(9.76 mmol/L KHP)的標(biāo)記率為69%；緩沖體系③(42.4 mmol/L醋酸鈉)的標(biāo)記率為61%。結(jié)果表明，不同緩沖體系對(duì)標(biāo)記率有一定影響，其原因可能為醋酸體系的pH受溫度的影響較大，并且加熱時(shí)醋酸會(huì)有一定程度的揮發(fā)，KHP體系pH受溫度影響較小(溫度由5 ℃升至60 ℃時(shí)pH僅由4.00升為4.09)，而pH值是影響標(biāo)記率大小的關(guān)鍵因素，因此，KHP緩沖體系②的標(biāo)記率為最高值69%。

(5)加入乙醇的體積

其它條件保持不變的情況下，分別向反應(yīng)體系中加入100 μL和500 μL乙醇時(shí)標(biāo)記率分別為55%和13%，加入乙醇反而使標(biāo)記率降低，這可能是因?yàn)榧尤胍掖冀档土穗x子強(qiáng)度的同時(shí)，反應(yīng)物的濃度也明顯降低。雖然降低離子強(qiáng)度能夠提高標(biāo)記率，但是反應(yīng)物的濃度也是影響標(biāo)記率高低的主要因素。

總之，用n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA和Al18F復(fù)合物通過(guò)螯合反應(yīng)快速方便的制備了n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA，合成時(shí)間為25～30 min，合成時(shí)間短，有利于標(biāo)記物今后的臨床應(yīng)用。最佳標(biāo)記條件為：10 μL 2.0 g/L n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA的去離子水溶液，3 μL 1 mmol/L AlCl3的去離子水溶液，10 μL 10 g/L抗壞血酸的0.122 mol/L KHP溶液和100 μL 37～74 MBq18F-的生理鹽水溶液混合后，用0.1 mol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0?；旌衔飺u勻后在105 ℃反應(yīng)20 min。即：在pH=4.0的KHP緩沖體系中，18F-的活度為37～74 MBq，反應(yīng)體系中多肽濃度為196.6 μmol/L，多肽和AlCl3的物質(zhì)的量之比為4.1∶1時(shí)，標(biāo)記率達(dá)最大值69%。據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)道，NOTA-Octreotide的濃度為765 μmol/L時(shí)的最佳標(biāo)記率為50%，和文獻(xiàn)值相比，在減少多肽用量和降低多肽濃度的條件下，標(biāo)記率提高19%。這可能和n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA的結(jié)構(gòu)有關(guān)，該化合物是用賴(lài)氨酸殘基Lys將NOTA和TOCA偶聯(lián)，Lys側(cè)鏈較長(zhǎng)，減小了空間位阻，這些因素可能在一定程度上影響其標(biāo)記率。

(6)產(chǎn)品純化和分析

標(biāo)記物經(jīng)HLB柱純化后用HPLC進(jìn)行分析，放化純大于95%，保留時(shí)間為12.12 min，比n-Gluc-Lys([Al19F]NOTA)-TOCA的保留時(shí)間滯后約0.42 min，如圖7，這是因?yàn)榉派湫詸z測(cè)器連接在紫外檢測(cè)器之后。標(biāo)記物生理鹽水溶液的外觀性狀為無(wú)色澄清透明液體，用精密pH試紙測(cè)得pH=5～6。

圖7 n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA HPLC分析圖譜

2.4 脂水分配系數(shù)

為了研究n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA的水溶性，測(cè)得其在正辛醇和PBS中的脂水分配系數(shù)lgP=-4.20±0.09(n=3)，說(shuō)明該化合物水溶性高，利于腎臟代謝，能夠降低肝膽中的攝取。文獻(xiàn)[16]報(bào)道[Al18F]NOTA-octreotide的lgP=-2.44±0.12。說(shuō)明該化合物C末端的羧基和糖基化作用增加了標(biāo)記物的水溶性，這和預(yù)期的結(jié)果一致。

2.5 體外穩(wěn)定性

n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA在磷酸緩沖液(PBS)(pH =7.24,0.02 mol/L)和小牛血清(BS)中37 ℃下孵育30、60、120 min后放化純沒(méi)有顯著變化，均大于95%，表明標(biāo)記物體外穩(wěn)定。120 min的HPLC分析圖譜示于圖8。

圖8 n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA體外穩(wěn)定性分析圖譜

2.6 正常鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)

n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA在正常鼠體內(nèi)分布數(shù)據(jù)列入表1。由表1可知：標(biāo)記物注入體內(nèi)30、60、120 min時(shí)，腎臟的放射性攝取值均為最高，說(shuō)明標(biāo)記物主要通過(guò)腎臟代謝；在血液中的攝取低、清除快；30、60、120 min時(shí)肝臟中的攝取很低，分別為(0.34±0.04)、(0.23±0.04)、(0.08±0.01)%ID/g，說(shuō)明標(biāo)記物不是通過(guò)肝膽代謝，這和最初的設(shè)計(jì)目標(biāo)一致；120 min時(shí)，骨中的放射性攝取僅為(0.46±0.13)%ID/g，進(jìn)一步證明了標(biāo)記物在體內(nèi)不易脫[18F]氟和Al18F，這和體外穩(wěn)定性結(jié)果一致；標(biāo)記物在SSTR有表達(dá)的胰腺中有攝取，表明其與生長(zhǎng)抑素受體有親和力?？傊瑥恼Ｊ篌w內(nèi)分布結(jié)果可以推斷，在后續(xù)顯像研究中，顯像本底較低，有利于獲取良好的PET顯像。荷瘤裸鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)和PET顯像研究正在進(jìn)行。

表1 n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA的正常鼠體內(nèi)分布

注(Note)：n=5

3 結(jié) 論

用Al18F復(fù)合物和n-Gluc-Lys(NOTA)-TOCA通過(guò)螯合反應(yīng)制備了n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA。標(biāo)記物水溶性高、體外穩(wěn)定、體內(nèi)外無(wú)脫[18F]氟和Al18F現(xiàn)象，主要通過(guò)腎臟代謝，與生長(zhǎng)抑素受體有親和力。血液本底低，在肝臟、肌肉、骨等其它正常組織中的攝取低。本工作為進(jìn)一步研究Al18F復(fù)合物標(biāo)記的奧曲肽衍生物作為生長(zhǎng)抑素受體陽(yáng)性腫瘤顯像劑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

致謝：感謝趙貴植研究員、鄧雪松、岳文強(qiáng)、溫凱、石翠燕、江曉、劉強(qiáng)、葛彪、殷胤、李雯等人在本文完成過(guò)程中給予的幫助，感謝原子高科醫(yī)學(xué)三部提供18F離子。

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