何冬蘭，邵坤彥，葉 程，黃 俊，尚敏邦

(中南民族大學生命科學院生物工程實驗室，武漢 430074)

谷氨酰胺轉胺酶(TG)是一種能夠催化蛋白質分子與分子間及分子內部?；M行轉移的酶[1].它不僅是一種新型的食品添加劑，還能促進傷口愈合、表皮分化、毛囊蛋白質架橋、胰島素分泌，誘導細胞分化，催化介導細胞凋亡，識別癌變細胞組織等[2-5].源于微生物的谷氨酰胺轉胺酶(MTG)對底物特異性要求低，分子中無Ca2+結合位點[6]，適用于工業(yè)化生產(chǎn)[7].

目前利用大腸桿菌PET系統(tǒng)生產(chǎn)重組MTG多在培養(yǎng)過程中添加IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖苷)誘導獲得.但IPTG有潛在的毒性且價格較貴，在大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)中應用受限.國內外研究者發(fā)現(xiàn)乳糖作為誘導劑表達大腸桿菌重組產(chǎn)物的優(yōu)越性，Sarduy[8]等利用乳糖誘導表達的惡性瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶(falcipain-2)菌體密度是用IPTG誘導表達的1.5倍,Yi[9]等在優(yōu)化T7系統(tǒng)控制的谷氨酸變位酶S時發(fā)現(xiàn)乳糖比IPTG更高效.本實驗利用乳糖代替IPTG誘導MTG表達，優(yōu)化適合重組MTG大腸桿菌pET22b-MTG/E.coliBL21(DE3)的誘導表達條件， 證實了以乳糖作誘導劑，對T7lac啟動子控制的重組目的產(chǎn)物可獲得很好的誘導表達效果，并利用親和層析等技術實現(xiàn)了MTG蛋白的純化.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

pET22b-MTG/E.coliBL21(DE3)及PCR引物1972R，0317R由中南民族大學生命科學學院分子微生物學實驗室保存.蛋白marker(美國Bio-Rad公司)，Ni Sepharose resin(美國GE公司)，DEAE Sephadex A-50(Amersham公司)，Sephadex G-75(武漢生命科技公司)，咪唑、TEMED(美國Sigma公司)，GSH、GSSG、DTT、β-巰基乙醇(德國Merck公司)，BamHⅠ、HindⅢ(日本TAKARA公司),其余為國產(chǎn)分析純.

自動凝膠圖像分析儀(JS-380A，上海培清科技公司)，PCR儀(Biometra公司)，垂直板電泳儀(DYCZ-24DN，北京六一儀器廠)，超聲波細胞破碎機(寧波新芝生物科技公司)，HD-4電腦核酸蛋白檢測儀、DBS-160電腦全自動部分收集器、HL-2B數(shù)顯恒流泵(上海滬西分析儀器廠)，LC-20AT HPLC(LC-20AT，日本島津公司)，掃描儀(Epson Perfection 4990 Photo，日本愛普生公司).

1.2 方法

1.2.1 重組菌的鑒定

取1年以上重組菌株，提取質粒，取3 μL質粒DNA，加1 μL 10×K buffer，0.5 μLBamHⅠ，0.5 μLHindⅢ，5 μL ddH2O，37 ℃酶切過夜，取5 μL溶液用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

另取1 μL重組質粒DNA ，加入5 μL PCR buffer，1 μL dNTP，引物各0.5 μL，0.3 μL Taq DNA聚合酶，18 μL ddH2O.PCR條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)29次；72 ℃ 10 min，4 ℃保溫40 min.取3 μL產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.2.2 pET22b-MTG自誘導培養(yǎng)及條件的優(yōu)化

將1%(體積比)的pET22b-MTG接種在含100 μg/mL氨芐的自誘導培養(yǎng)基[10](含10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母浸粉，10 g/L NaCl，0.32 g/L葡萄糖，一定含量的乳糖，4.4 g/L甘油，25 mmol/L KH2PO4，17.7 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L MgSO4)中，220 r/min,26 h，37℃，發(fā)酵過夜，定時取樣測定A600，初步確定菌株的生長曲線，并與IPTG誘導的生長曲線相比較.條件優(yōu)化后取樣作SDS-PAGE分析并測蛋白濃度：(1)最佳培養(yǎng)溫度的確定：在乳糖自誘導條件下，分別將4個50 mL的搖瓶置25，28，37，45℃培養(yǎng)20 h，取1.0 mL菌液；(2)乳糖濃度的確定：分別配置含乳糖0，0.8，1.2，1.6 g/L的乳糖自誘導培養(yǎng)基，接種1% pET22b-MTG，分別在18，20 h時取樣；(3)乳糖誘導時間的確定：從培養(yǎng)10 h起，隔2 h取樣一次；(4)誘導pH的確定：調整培養(yǎng)基的pH值分別為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，接種后18 h取樣.

1.2.3 升溫誘導對pET22b-MTG的影響

在8個50 mL的乳糖誘導培養(yǎng)基中，同時接種1%的pET22b-MTG/E.coliBL21(DE3).除對照瓶外，其余分別在0，10.5，11.5，12.5，13.5，14.5，15.5 h時放入50℃搖床熱誘導1 h，并于28℃搖床培養(yǎng)至18 h，取樣檢測.

1.2.4 目的蛋白定位

在最優(yōu)條件下誘導表達pET22b-MTG/E.coliBL21(DE3)，取25 mL發(fā)酵液，12000 rpm離心15 min，用10 mL洗滌液(140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，pH 7.4)洗滌后，加2 mL裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，10%甘油，5 mmol/L DTT，pH 8.0)，混勻1 h，超聲破碎儀破胞，離心取上清，沉淀用包涵體溶解液(50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl，8 mol/L 尿素，5 mmol/L DTT，pH 7.5)溶解.可溶性蛋白和包涵體蛋白分別作SDS-PAGE確定表達產(chǎn)物的分布.

1.2.5 表達產(chǎn)物的純化

收集可溶性蛋白50 mL，0.22 μm濾膜過濾，超聲去氣泡.用緩沖液(20 mmol/L PBS，20 mmol/L NaCl ，pH 6.5)沖洗Sephadex G-75柱子至基線水平后，上樣，用同一緩沖液洗脫，收集A280洗脫峰檢測.

50 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.5)沖洗DEAE Sephadex A-50柱，上樣后依次用含0.05，0.10，0.15，0.20，0.30，0.50，0.80，1.00，2.00 mol/L NaCl的PBS緩沖液洗脫，收集A280洗脫峰檢測.

清洗HPLC通路，將Ni+葡聚糖凝膠柱與HPLC連接，用脫氣的二次水洗滌凝膠柱至基線水平.用上樣緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 7.4)平衡后上樣,再用上樣緩沖液洗滌Ni柱，待基線水平后，進洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 7.4)，收集A280洗脫峰檢測.

1.2.6 MTG的酶活測定與蛋白質濃度測定

按照Grosswicz[11]等的方法測定純化過程中酶活，37℃時，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol L-谷氨酰-γ-單氧肟酸的酶量定義為一個單位谷氨酰胺轉胺酶的酶活.

2 結果與分析

2.1 重組菌pET22b-MTG/E.coli BL21(DE3)的質粒雙酶切鑒定與PCR鑒定

pET22b-MTG的質粒提取后經(jīng)電泳檢測結果見圖1.由圖1可見，1、 2、3泳道顯示兩條約6.7kb和4.0 kb的電泳條帶，pET22b-MTG的質粒約6750bp.

Lane1-3：重組質粒；M：λDNA/HindⅢ marker

質粒DNA經(jīng)BamH I、Hind III雙酶切過夜孵育后結果見圖2.由圖2可見，1、2、3、4泳道出現(xiàn)兩條約5.5 kb和1.3 kb的電泳條帶.而pET22b和MTG片段的大小分別為6750 bp和1257 bp，與電泳條帶大小相符，證明MTG基因已成功與pET22b載體連接.

M：λDNA/HindⅢ marker；Lane 1～4：重組質粒

pET22b-MTG的質粒DNA經(jīng)PCR擴增后(見圖3)，于1257 bp處呈亮帶，證明重組菌中的MTG目的片段已被成功插入載體.

圖3 重組質粒PCR電泳圖

2.2 誘導條件的優(yōu)化

2.2.1 生長曲線的初步測定

乳糖(0 h添加)和IPTG(14 h添加)誘導pET22b-MTG/E.coliBL21(DE3)菌株的生長曲線見圖4.由圖4可見，12 h前菌體生長均較緩慢，14 h 添加IPTG，此時菌株A600=0.552.26 h時3組菌均進入穩(wěn)定期，IPTG誘導的菌株A600=1.862，與對照(無誘導劑)A600=1.702無明顯差別；而乳糖誘導的菌株A600=2.135，明顯高于其他兩組.

t/h

2.2.2 誘導溫度的確定

不同溫度下MTG表達量的SDS-PAGE結果見圖5.經(jīng)BandScan 5.0軟件分析蛋白條帶得MTG相對表達量，用Bradford法[12]測定總蛋白表達濃度，結果見圖6.由圖5可見，28℃下(Lane 3)MTG表達量最大.由圖6可見，MTG相對表達量與總蛋白表達量在28℃時均有最大值；37℃時，總蛋白的量較大，而MTG的表達量不高，證明重組菌最佳誘導溫度是28℃.

M：Protein marker；Lane 1：45℃；Lane 2：37℃；Lane 3：28℃；Lane 4：25℃

圖6 不同溫度下的MTG相對表達量和總蛋白濃度

2.2.3 乳糖濃度的確定

20h、18h時不同濃度的乳糖誘導MTG的SDS-PAGE和總蛋白表達量的測定結果分別見圖7、圖8.由圖7可見，當乳糖的濃度為1.2 g/L，培養(yǎng)18 h(Lane 6)蛋白的表達量較高.由圖8可見，MTG最高相對表達量為20.4%，在18 h時總蛋白的表達量為12.5 g/L.

Lane 1：20 h,1.6 g/L乳糖；M：Protein marker；Lane 2～4：1.2，0.8，0 g/L乳糖(20 h)；Lane 5～8：1.6，1.2，0.8，0 g/L乳糖(18 h)

圖8 不同乳糖濃度下的MTG相對表達量和總蛋白濃度

2.2.3 誘導時間的確定

乳糖誘導不同時間后的MTG的SDS-PAGE和表達量分析結果分別見圖9、圖10.由圖9、圖10可見，18 h(Lane 2)后，MTG的表達量最高，其相對表達量為24%，此時總蛋白的濃度為18.69 g/L.

Lane 1～6：20，18，16，14，12,10h；M：Protein marker

圖10 不同誘導時間下的MTG相對表達量和總蛋白濃度

2.2.4 誘導pH的確定

在不同pH值下菌株經(jīng)乳糖誘導18 h后，SDS-PAGE電泳結果和蛋白表達量分析見圖11和圖12.由圖11、圖12可見，當誘導的pH為7.0(Lane 4)時，MTG的相對表達量最大，為11.2%，此時總蛋白濃度是9.54 g/L.

M：Protein marker；Lane 1～6：pH 8.5，8.0，7.5，7.0，6.5，6.0

圖12 不同pH下的MTG相對表達量和總蛋白濃度

2.2.5 升溫起始時間的確定

在不同起始時間開始升溫誘導MTG表達，SDS-PAGE電泳結果與蛋白表達分析見圖13和圖14.由圖13、圖14可見，當乳糖誘導培養(yǎng)11.5 h(Lane 4)時，升溫至50℃誘導1 h再放入28℃培養(yǎng)，MTG表達量增大，其相對表達量為23.6%，總蛋白濃度為14.53 g/L.

Lane 1：對照；Lane 2～8：0，10.5，11.5，12.5，13.5，14.5，15.5 h時開始誘導1 h；M：Protein marker

圖14 不同時刻升溫MTG相對表達量和總蛋白濃度

2.2.6 乳糖誘導與IPTG誘導的比較

乳糖誘導與IPTG誘導的比較結果見圖15.由圖15可見，乳糖誘導MTG的表達量(Lane 2)明顯高于IPTG誘導MTG的表達量(Lane 1)，經(jīng)軟件分析前者是后者的3.7倍.同時測得IPTG和乳糖誘導條件下的蛋白濃度分別為7.24 g/L和18.8 g/L，乳糖誘導的菌體總蛋白濃度是IPTG誘導的2.6倍.說明可用乳糖替代IPTG誘導本工程菌株.在50～75KD之間出現(xiàn)了兩個條帶，是由于在升溫過程中某些熱激基因被激活.

M：Protein marker；Lane 1：IPTG誘導MTG；Lane 2：乳糖誘導MTG

2.3 MTG的定位與純化

2.3.1 MTG的定位

將全菌、可溶性蛋白與包涵體蛋白分別進行SDS-PAGE電泳后結果見圖16.由圖16可見，MTG主要存在于pET22b-MTG上清液中(Lane 3)，有利于進一步的純化.

Lane 1：pET22b-MTG全菌；Lane 2：pET22b-MTG包涵體溶解液；Lane 3：pET22b-MTG上清蛋白；Lane 4：pET22b全菌液；M：Protein marker

2.3.2 MTG的凝膠過濾分離

將pET22b-MTG上清溶液用一次性針頭濾器過濾后，進行Sephadex G-75凝膠過濾層析，結果見圖17.由圖17可見兩個洗脫峰，1、2洗脫峰為非均一對稱的單峰.經(jīng)酶活檢測，MTG位于2峰中.

圖17 MTG蛋白凝膠過濾洗脫譜圖

2.3.3 MTG的離子交換分離

MTG的離子交換分離的結果見圖18.由圖18可見，當洗脫溶液中的鹽離子濃度為0.1,0.5,0.8,1.0,2.0 mol/L時均出現(xiàn)了洗脫峰，經(jīng)酶活檢測，0.8 mol/L的洗脫峰有酶活，收集并進行親和層析分離.

圖18 MTG蛋白離子交換洗脫譜圖

2.3.4 MTG的親和層析分離

MTG的親和層析分離的結果見圖19.由圖19可見，用Ni柱分離酶液時出現(xiàn)了單一峰，該峰曲線平滑且左右對稱，證明該處洗脫的蛋白較純.

圖19 MTG蛋白Ni柱洗脫峰

2.3.5 MTG純化后的檢測

MTG經(jīng)凝膠過濾、離子交換及親和層析后，將多批次純化的終酶液合并，取樣進行SDD-PAGE電泳，結果見圖20.由圖20可見，在47KD處出現(xiàn)了單一條帶，標志著MTG已達到電泳純狀態(tài).

Lane 1：純化后的酶液；M：Protein marker

2.4 MTG的酶活與蛋白濃度的測定

取超聲破碎后上清，凝膠過濾、離子交換、Ni柱純化后酶液測定結果見表1.由表1可知，凝膠過濾后的酶液由于稀釋倍數(shù)大，酶活為0.66 U/mL，低于上清中的酶活；但比活力(1.05 U/mg)為上清(0.16 U/mg)的6.5倍.隨著酶蛋白溶液的逐次純化，比活力值逐漸升高，終酶液的比活力為10.91 U/mg，純化倍數(shù)為初始上清的68.2倍.

表1 MTG蛋白純化情況

3 討論

本文對重組MTG工程菌pET22b-MTG /E.coliBL21(DE3)的乳糖誘導條件進行優(yōu)化，確定了適合重組菌生長和MTG蛋白表達的條件，其中乳糖濃度為1.2 g/L，pH為7.0，在28℃誘導18 h,培養(yǎng)11.5 h時升溫表達量最大.培養(yǎng)過程中采取28℃→50℃→28℃的變溫模式,最終獲得了濃度為18.8 g/L的表達產(chǎn)物.

常規(guī)的溫度誘導模式是：當菌體生長到一定密度時，將培養(yǎng)條件從30 ℃升高至42 ℃，由于42 ℃時cI857基因失活，解除阻遏后的啟動子開始啟動外源基因的表達[13].而谷氨酰胺轉胺酶本身具有較高的熱穩(wěn)定性，最適溫度為50 ℃左右，在45～55 ℃范圍內都具有較高的活性.丁滿生[14]等在研究溫度誘導模式對重組大腸桿菌質粒拷貝數(shù)的影響時確立了二次升溫誘導模式，發(fā)現(xiàn)二次升溫誘導與一次升溫誘導相比表達量提高了80%.

本文對重組菌乳糖誘導后，提取可溶性蛋白溶液，再經(jīng)凝膠過濾、離子交換、親和層析，獲得純度較高的MTG，與最初有活性的酶液相比，純化了近70倍.但由于只研究了一步升溫誘導對重組菌pET22b-MTG /E.coliBL21(DE3)的影響，不同溫度誘導模式對重組菌的影響可待進一步的研究.

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