程 寒，袁 琳，明 月，楊天鳴，程介克

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074;2 武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，武漢 430072)

細(xì)胞是生物體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單位，其體積很小，樣品量很少. 細(xì)胞群體分析所獲得的統(tǒng)計平均結(jié)果，掩蓋了單個細(xì)胞之間的差異，使生物學(xué)及醫(yī)學(xué)等很多領(lǐng)域的發(fā)展受到限制.

微流控芯片已用于各種細(xì)胞分析的研究，如細(xì)胞輸送[1]、進(jìn)樣[2，3]、培養(yǎng)[4]、分類[4]、分離[5，6]和溶胞[7].電化學(xué)檢測具有靈敏度高、選擇性好，易于微型化和集成化等優(yōu)點(diǎn)，已成為微流控芯片電泳中最具有發(fā)展前途的檢測方法之一. 芯片上集成電化學(xué)檢測器的挑戰(zhàn)主要在于電極與分離通道出口的準(zhǔn)確定位.現(xiàn)有的設(shè)計大多是利用光刻蝕法或化學(xué)沉積法將工作電極置于通道出口處[8-10]，電極損壞后，芯片也隨之報廢.本研究以碳纖維納米電極為工作電極，自行組裝了微流控芯片安培柱末檢測系統(tǒng)，設(shè)計了一種微流控芯片電泳單細(xì)胞進(jìn)樣和溶膜的控制方式，僅需一路高壓控制即可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞進(jìn)樣和溶膜操作.該系統(tǒng)具有良好的重現(xiàn)性，更換電極后可重復(fù)使用.鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細(xì)胞(PC12)中含有兒茶酚胺類物質(zhì)多巴胺[11-13]，適于電化學(xué)方法進(jìn)行檢測. 筆者以PC12細(xì)胞為研究對象，實(shí)現(xiàn)了單個細(xì)胞在自組裝微流控芯片電化學(xué)檢測系統(tǒng)上的進(jìn)樣、溶膜和檢測，分析了單個細(xì)胞中的多巴胺含量.

1 材料和方法

1.1 儀器

電化學(xué)工作站(CHI660，上海辰華儀器公司)；高壓電源(XCDY，山東師范大學(xué)化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院)；倒置顯微鏡(XDP-1, 上海光學(xué)儀器廠).

1.2 試劑

PC12細(xì)胞購自中國典型物保藏中心，多巴胺(DA)、腎上腺素(NE)、去甲腎上腺素(E)以及兒茶酚(CA)為Sigma公司產(chǎn)品，十二烷基硫酸鈉(SDS)為國產(chǎn)化學(xué)純，其他試劑均國產(chǎn)分析純.細(xì)胞培養(yǎng)及電泳實(shí)驗(yàn)中所有溶液均用超純水配置，待測物用0.1 mol/L的HClO4配置成1.0×10-2mol/L的母液，置于4℃的冰箱冷藏室中保存，使用時用相應(yīng)的緩沖溶液稀釋到所需濃度.

1.3 自組裝集成電化學(xué)檢測器

自組裝置見圖1.毛細(xì)管電泳芯片(AMC-μchip-T180, Alberta Microelectronic Corporation，Canada). 進(jìn)樣通道為雙T布局，通道寬50 μm，高20 μm，截面近似半圓，分離通道長76 mm，雙T進(jìn)樣通道長250 μm.樣品池S、緩沖液池B和廢液池SW距離雙T交叉通道均為5 mm.在毛細(xì)管電泳芯片原廢液池處截斷，將芯片粘在一塊載波片上，另外一塊凹形的3 mm厚的有機(jī)玻璃片與載波片和芯片粘連，形成電化學(xué)檢測池. 納米碳纖維電極的制作方法見文獻(xiàn)[14]，電極尖端的直徑控制約為100 nm. 將納米碳纖維電極夾在微操縱手上，在顯微鏡下用五維操縱器將工作電極的尖端對準(zhǔn)分離通道軸心，距離分離通道出口約30 μm，用粘膠將工作電極粘在檢測池上，待粘膠固化后即可移走微操縱手，從而將工作電極集成到芯片上.將Ag/AgCl參比電極靠近檢測點(diǎn)，粘在檢測池上.將離心管切去一段，對準(zhǔn)芯片上另外3個小槽粘好，作為儲液池.如需更換工作電極，用刀片切除工作電極上的粘膠，取下電極，用同樣的方法另外粘上一根工作電極并固定即可.芯片可以長期反復(fù)使用.用此法集成的電化學(xué)檢測器重現(xiàn)性優(yōu)良.

S為樣品池, B為緩沖液池, SW為樣品廢液池,DC為檢測池, RE為參比電極, WE為工作電極

1.4 PC12細(xì)胞懸液制取

PC12細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中消化取出置于10 mL離心管中，于800 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min，棄去培養(yǎng)液，用生理鹽溶液清洗5次并用血球記數(shù)板計數(shù)，收集細(xì)胞，將細(xì)胞中加入適量的PBS，并用移液槍對細(xì)胞液進(jìn)行吹打，形成均勻的細(xì)胞懸液，并控制細(xì)胞懸液的密度約5×104cells/mL.

2 結(jié)果與分析

2.1 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

通過測量DA在微流控芯片上所得結(jié)果，分析電泳的重現(xiàn)性. 電泳條件：20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)作為電泳緩沖溶液，樣品池中加入1.0×10-4mol/L DA，其它液池中為電泳緩沖液，進(jìn)樣電壓500 V， 進(jìn)樣時間20 s，分離電壓1000 V，工作電極電位0.6 V(vs Ag/AgCl).圖2為0.1 mmol/L DA標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)10次進(jìn)樣的電泳圖譜. 圖2中實(shí)線箭頭所指即為DA的電泳峰，2個虛線箭頭所指為電泳的進(jìn)樣電壓與分離電壓切換時工作電極上出現(xiàn)的電流峰(峰寬約1 s), 其余部分電壓切換時的電流峰以及DA電流峰未逐一標(biāo)示.

t/s

表1為0.1 mmol/L DA 連續(xù)10次進(jìn)樣分離的峰高及遷移時間，計算得出峰高相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.40 %, 遷移時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.52%，通過實(shí)驗(yàn)計算出同一根電極檢測0.1 mmol/L DA 連續(xù)40次進(jìn)樣峰高與遷移時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.27 %和1.31 %.

表1 連續(xù)10次進(jìn)樣分離結(jié)果的重復(fù)性比較

由上分析可知，工作電極固定在芯片通道的出口處，電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)出良好的重復(fù)性.該設(shè)計方便了實(shí)驗(yàn)操作，在固定的工作電極鈍化或毀壞之前，微流控芯片可持續(xù)使用而不必調(diào)整電極位置，且芯片電泳實(shí)驗(yàn)勿需在顯微鏡平臺上進(jìn)行；該設(shè)計可方便快速更換電極.較未將工作電極組裝在微流控芯片上的系統(tǒng)相比，本裝置能顯著節(jié)省實(shí)驗(yàn)時間，從而提高實(shí)驗(yàn)效率.

2.2 兒茶酚及兒茶酚胺類物質(zhì)的分離

筆者在自組裝測試系統(tǒng)上進(jìn)行了兒茶酚及兒茶酚胺類物質(zhì)的分離和檢測，電泳條件：20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)作為電泳緩沖溶液，500 V進(jìn)樣20 s，分離電壓1000 V，工作電極電位0.6 V(vs Ag/AgCl)，實(shí)驗(yàn)中保持各液池液面高度于同一水平面； NE、CA的濃度均為1.0×10-5mol/L，DA、E的濃度均為5.0×10-6mol/L . 在此條件下DA與CA可達(dá)到基線分離，而DA、E、NE分離效果則不佳，尤其E和NE的電泳峰發(fā)生嚴(yán)重重疊.在電泳緩沖溶液中加入0.1 % SDS 可顯著改善DA、E、NE的分離度，并可得其分開的電泳峰. 與傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳相比，分析速度有了很大提高，結(jié)果見圖3. 由圖3可見，4種電活性物質(zhì)得到了較好的分離，其分離度由左至右依次為：2.24，1.66，2.18.

t/s

2.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳分析

電泳在未經(jīng)修飾的芯片通道中進(jìn)行，每次電泳實(shí)驗(yàn)前芯片通道依次浸泡0.1 mol/L HCl(15 min)，超純水(10 min)，Tris-HCl(pH 8.0)緩沖溶液(30 min)，進(jìn)行預(yù)處理.所有電泳實(shí)驗(yàn)均為進(jìn)樣時樣品池加進(jìn)樣電壓，樣品廢液池接地，其它2個液池懸浮；分離時緩沖溶液池加分離電壓，檢測池接地，其它2個液池懸浮，實(shí)驗(yàn)過程中保持4個液池的液面水平.圖4為1.0×10-4mol/L DA標(biāo)準(zhǔn)樣品的電泳圖譜，樣品池中加入1.0×10-4mol/L DA，其他液池中均為電泳緩沖溶液，進(jìn)樣與分離電壓分別為500 和1000 V，工作電極電位為0.6 V(vs. Ag/AgCl).遷移時間(tm)和半峰寬(W1/2)分別為71.0 和 9.0 s. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一系列不同濃度的DA標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳分析，得到線性回歸方程y=2×10-5x+3×10-11，電泳峰高與DA濃度成正相關(guān)，R2=0.9989，DA濃度在1×10-7～1×10-4mol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，采用該方法定量較為可靠.

t/s

2.4 單細(xì)胞進(jìn)樣及分析

芯片通道依次用0.1 mol/L HCl，超純水及電泳緩沖溶液浸泡處理，樣品池中加入細(xì)胞懸液(120 μL)，緩沖液池中加入含0.1 % SDS的Tris-HCl(pH 8.0)緩沖溶液，樣品廢液池及檢測池中均加入Tris-HCl(pH 8.0)緩沖溶液，除樣品池外，緩沖液池和樣品廢液池中分別加入100 μL溶液，檢測池的液面高度與緩沖液池和樣品廢液池高度平行，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，若細(xì)胞懸液中細(xì)胞密度過大，芯片通道口容易被細(xì)胞堵塞，若細(xì)胞懸液中細(xì)胞密度過小，細(xì)胞不易進(jìn)入通道，當(dāng)細(xì)胞密度調(diào)整為約5×104cells/mL時，在上述液面高度差的條件下，細(xì)胞能以大約2 s的時間間隔依次進(jìn)入樣品通道，細(xì)胞進(jìn)樣溶膜的過程見圖5. 當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入雙T通道的瞬間施加1000 V分離電壓，細(xì)胞在分離電場以及SDS的作用下迅速溶膜.

(a)單個細(xì)胞位于樣品池 (b)進(jìn)入樣品通道 (c)出現(xiàn)在雙T通道 (d)溶膜 (e)分離檢測

圖6為以納米碳纖維電極作電化學(xué)檢測器2次檢測所得單個PC12細(xì)胞的單個電泳峰，實(shí)際樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的測定采用同一根工作電極，工作電極的檢測電位為0.6 V(vs. Ag/AgCl). 據(jù)報道PC12細(xì)胞中含有的主要電活性物質(zhì)為DA[13,15]，對比實(shí)際樣品,與標(biāo)準(zhǔn)DA電泳圖譜的遷移時間基本一致，可判斷所檢測到的信號為DA電泳峰.由于實(shí)驗(yàn)采用的芯片雙T進(jìn)樣通道長250 μm，標(biāo)準(zhǔn)樣品的進(jìn)樣量較單個細(xì)胞破膜液(直徑約15 μm)的大，電泳峰寬也相應(yīng)較大.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DA樣品的工作曲線計算出單個細(xì)胞中DA含量，得到5個單個PC12細(xì)胞中DA含量分別為0.73，0.64，0.95，1.28和0.42 fmol，單個PC12細(xì)胞中DA平均含量為0.80±0.33 fmol，盡管實(shí)驗(yàn)采用的為同一批細(xì)胞，由于細(xì)胞之間存在大小、生長狀態(tài)等個體差異，導(dǎo)致單個PC12細(xì)胞中的DA含量有較大差異，結(jié)果與文獻(xiàn)[15]相近，較文獻(xiàn)[16]偏低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能基于細(xì)胞的來源不同所致.

t/s t/s

3 結(jié)語

采用自組裝的微流控芯片檢測系統(tǒng)安培法柱末檢測模式，以納米碳纖維電極為工作電極，實(shí)現(xiàn)了對4種兒茶酚胺類物質(zhì)的基線分離檢測，設(shè)計了一種在微流控芯片電泳中單個細(xì)胞連續(xù)進(jìn)樣和溶膜的控制方式，僅需一路高壓控制即可實(shí)現(xiàn).按照這一設(shè)計，在自行組裝的微流控芯片電化學(xué)檢測系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)了單個PC12細(xì)胞快速進(jìn)樣、溶膜及分析.

[1]Omiatek D M, Santillo M F, Heien M L. Hybrid capillary-microfluidic device for the separation, lysis, and electrochemical detection of vesicles [J]. Anal Chem, 2009, 81: 2294-2302.

[2]Xia F Q, Jin W R, Yin X F, et al. Single-cell analysis by electrochemical detection with a microfluidic device [J]. J Chromatogr A, 2005, 1063: 227-233.

[3]Lai C C J, Chen C H, Ko F H. In-channel dual-electrode amperometric detection in electrophoretic chips with a palladium film decoupler [J]. J Chromatogr A, 2004, 1023: 143-150.

[4]Lindstr?m S, Andersson-Svahn H. Overview of single-cell analyses: microdevices and applications [J]. Lab Chip, 2010(10): 3363-3372.

[5]Roman G T, Chen Y L, Viberg P, et al. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices [J]. Anal Bioanal Chem, 2007, 387: 9-12.

[6]Gao J, Yin X F, Fang Z L. Integration of single cell injection, cell lysis, separation and detection of intracellular constituents on a microfluidic chip [J]. Lab Chip, 2004(4): 47-52.

[7]Zhang X Y, Li Q L, Chen Z Z, et al. Electrokinetic gated injection-based microfluidic system for quantitative analysis of hydrogen peroxide in individual HepG2 cells [J]. Lab Chip, 2011(11): 1144-1150.

[8]Woolley A T, Lao K, Glazer A N, et al. Capillary electrophoresis chips with integrated electrochemical detection [J]. Anal Chem, 1998, 70: 684-688.

[9]Wang J, Tian B M, Sahlin E. Integrated electrophoresis chips/amperometric detection with sputtered gold working electrodes [J]. Anal Chem, 1999, 71: 3901-3904.

[10]Zamaleeva A I, Sharipova I R, Shamagsumova R V, et al. A whole-cell amperometric herbicide biosensor based on magnetically functionalised microalgae and screen-printed electrodes [J]. Anal Methods, 2011(3): 509-513.

[11]Cheng H, Huang W H, Chen R S, et al. Carbon fiber nanoelectrodes applied to microchip electrophoresis amperometric detection of neurotransmitter dopamine in rat pheochromocytoma (PC12)cells [J]. Electrophoresis, 2007, 28: 1579-1586.

[12]Shi B X, Huang W H, Cheng J K. Determination of neurotransmitters in PC12 cells by microchip electrophoresis with fluorescence detection [J]. Electrophoresis, 2007, 28: 1595-1600.

[13]Mir T A,Shinohara H,Shimizu Y. Enzyme-luminescence method:tool for evaluation of neuronal differentiation based on real-time monitoring of dopamine release response from PC12 cells [J]. Anal Methods,2011,3:837-841.

[14]Huang W H, Pang D W, Tong H, et al. A method for the fabrication of low-noise carbon fiber nanoelectrodes [J]. Anal Chem, 2001, 73: 1048-1052.

[15]Zhang L Y, Qv S F, Wang Z L, et al. Determination of dopamine in single rat pheochromocytoma cell by capillary electrophoresis with amperometric detection [J]. J Chromatogr B, 2003, 792: 381-385.

[16]Gilman S D, Ewing A G. Analysis of single cells by capillary electrophoresis with on-column derivatization and laser-induced fluorescence detection [J]. Anal Chem, 1995, 67: 58-64.