彭峰林 ，張 林 ，郭艷菊 ，莫偉彬 ，廖慧萍

不同強度耐力運動訓練對大鼠心肌細胞ATP敏感性鉀通道表達的影響

彭峰林1，2，張 林3，郭艷菊1，莫偉彬1，廖慧萍1

目的：探討不同強度耐力運動訓練對大鼠心肌ATP敏感性鉀通道表達的影響。方法：40只雄性SD大鼠，隨機分為對照組、大強度組、中強度組和小強度組。建立大鼠運動模型，采用RT-PCR技術與Western blot技術，檢測大鼠心肌KATP各亞基的表達。結果：RT-PCR結果顯示，大強度組和中等強度組Kir6.1的基因表達明顯高于對照組；大強度組、中等強度組及小強度組Kir6.2的基因表達顯著高于對照組；大強度組、中等強度組及小強度組SUR2的基因表達均顯著高于對照組；在大鼠心肌組織中未能檢測到SUR1的基因表達。Western blot結果與PCR結果基本相同，但小強度組Kir6.1蛋白表達也明顯高于對照組。結論：各種強度的長期耐力運動訓練可增加KATP的表達。

耐力運動；大鼠；心肌細胞；ATP敏感性鉀通道；基因表達；蛋白表達

ATP敏感性鉀通道（ATP sensitive potassium Channel，KATP）是由Noma于1983年利用膜片鉗技術在豚鼠心室肌上首先發(fā)現(xiàn)的[1]，隨后證實KATP在缺血再灌注過程中對心肌具有保護作用。KATP包括肌膜KATP通道（sarc－KATP）和線粒體KATP通道（mito－KATP），sarc－KATP存在于細胞膜上，由內向整流鉀通道（Kir）和磺酰脲受體（SUR）組成。mito－KATP存在于線粒體內膜，但 mito－KATP的結構尚未完全清楚。目前已克隆兩個內向整流亞單位Kir6．1、Kri6．2和三個磺脲類亞單位SUR1、SUR2A和SUR2B。在短時間缺血時sarc－KATP開放可引起心臟保護效應[2]，mito－KATP可能是缺血預適應（IPC）的終末效應器[3]。為了探索不同強度運動訓練對心肌細胞KATP表達產(chǎn)生的影響，本研究設計了實驗方案，從基因表達水平及蛋白表達水平來檢測不同強度耐力訓練對大鼠心肌KATP亞基表達的影響，與以往研究不同處在于，本研究既設計了不同強度的運動訓練方案，同時檢測了KATP各亞基的基因表達和蛋白表達變化，這將為進一步探索KATP在心肌運動適應性變化中的作用和機理提供充實的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

11周齡Sprague－Dawley雄性大鼠40只（上海斯萊克實驗動物有限任公司提供），隨機分為大、中、小3個運動負荷組和對照組。飼養(yǎng)條件：動物房維持在溫度（22±2）℃，濕度 60%±%5，每日照明12 h，自由進食飲水，喂養(yǎng)飼料采用國家標準固體混合飼料，大鼠自由飲水進食。

1.2 實驗方法

1.2.1 訓練方法 跑臺訓練8周，第1周為適應性訓練，每周訓練6天，每天訓練60 min。依據(jù)Bedford[4]的研究結果制定運動負荷，大強度組：坡度 10°，速度 26．8 m/min，相當于最大耗氧量92．3%±2．8%；中等強度：坡度 5°，速度 15．2m/min，相當于最大耗氧量 64．0%±4．5%；小強度組：坡度 0°，速度 8．2m/min，相當于最大耗氧量52．9%±3．1%。對照組不做任何訓練，常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動。在末次訓練結束后24 h進行動物急性處理，采樣并測試。1.2.2 心肌組織KATP基因表達的測定 心尖部位無菌操作取100 mg心肌，Trizol試劑盒提取心肌總RNA，操作方法同試劑盒（RNAisoTM Plus，Takara）說明書，將提取出的RNA于－20℃保存。測OD值計算RNA含量，RNA電泳，紫外燈下可顯示清晰的28S、18S兩個條帶，5S條帶亦可見。

PT－PCR反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。貯存于4℃。

引物（由金思特南京科技有限公司合成），dsGAPDH（432 bp）：上游引物為 5′－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3′；下游引物為 5′－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3′。Kir 6．1（209 bp）：上游引 物 為 5′GAGTGAACTGTCGCACCAGA3′； 下 游 引 物 為 5′CGATCACCAGAACTCAGCAA3′。Kir6．2（167 bp）：上游引物為 5′TCCAACAGCCCGCTCTAC3′；下游引物為 5′GATGGGGACAAAA CGCTG3′。SUR1（210bp）：上游引物為 5′GGAGCAATCCAGACC AAGAT3′；下游引物為 5′Reverse：AGCCAGCAGAATGATGACA G 3′。SUR2（231 bp）：上游引物為 5′ACACGCTCCGCTCTAGAC TG3′；下游引物為 5′GCCAGGCAGAACAGCTGTCT3′。

擴增產(chǎn)物檢測。應用1．2%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，電泳后使用βandScan4．0軟件對目的條帶進行光密度分析，所得數(shù)值與相應β－actin光密度的比值即為mRNA的相對含量。

1.2.3 心肌組織KATP蛋白表達的測定 制備樣品蛋白：取新鮮心肌標本以生理鹽水充分沖洗，置液氮速凍后－80℃保存。把組織剪切成細小的碎片，裂解液裂解，冰上勻漿，至充分裂解。離心，取上清－20℃保存。

電泳：安裝電泳槽，配制15%SDS－PAGE分離膠，灌膠，封膠。配制5%的濃縮膠，灌膠，上梳，填滿空隙，放置30 min，去離子水洗滌。放入電泳槽，倒入電泳緩沖液，加樣品，樣品在沸水中煮沸，每井10 μL。80 V 20 min后調至120 V電泳1 h左右，至溴酚藍跑出膠板。染色4 h，脫色5 h。

免疫印跡：將凝膠移至盛有水的平皿中，浸洗3次，轉移至電泳緩沖液中，室溫浸泡3 h。準備NC膜，濾紙，NC光面向上，凝膠置于其上，放入電轉移槽。14V，100 mA，轉印2 h。封閉過夜。NC 置于單克隆抗體 mouse－anti－Kir6．1/Kir6．2/SUR2（1：300）液中，緩搖2 h。PBS/T洗膜3次，每次15 min，將NC置于1：2000 稀釋的 goat－anti－mouse IgG，室溫緩搖 2 h。PBS/T 洗膜 3次，每次10 min，將NC置于DAB底物中反應著色拍照。

結果半定量：以 β－actin 代替 mouse－anti－Kir6．1/Kir6．2/SUR2重復免疫印跡實驗，在底片上得到內參β－actin的條帶。圖像分析系統(tǒng)掃描條帶灰度值，用底片上mouse－anti－Kir6．1/Kir6．2/SUR2條帶的灰度值與內參β－actin條帶的恢度值的比值半定量分析的 Kir6．1/Kir6．2/SUR2 表達量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 12．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料均以平均數(shù)±標準差（±S）表示。采用單因素方差分析及多重比較，以 P＜0．05為有顯著性差異，以P＜0．01為有非常顯著性差異。

2 結 果

2.1 耐力運動對KATP亞基在轉錄水平的影響

RT－PCR后比較KATP各亞基與GAPDH基因表達的比值，大強度組和中等強度組的Kir6．1的基因表達明顯高于對照組（P＜0．01）；大強度組、中等強度組及小強度組的Kir6．2的基因表達顯著高于對照組（P＜0．05 或 P＜0．01）；大強度組、中等強度組及小強度組的SUR2的基因表達均顯著高于對照組（P＜0．05或P＜0．01）；在大鼠心肌組織中未能檢測到SUR1的基因表達（見圖1）。

圖1 各組大鼠心肌細胞KATP亞基基因表達（GAPDH為內參），Hig：大強度組；Mid：中強度組；Low：小強度組；Con：對照組Fig.1 Relative expression levels of KATP subunits Kir6.1，Kir6.2 and SUR2 mRNA in myocardial cells in different groups.▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，vs control group.

2.2 耐力運動對KATP亞基在翻譯水平的影響

Western blot實驗蛋白電泳結果見圖2，比較KATP各亞基與β－actin條帶的灰度比值，發(fā)現(xiàn)小強度組、中等強度組和大強度組 Kir6．1 的蛋白表達明顯高于對照組（P＜0．05）；大強度組、中等強度組及小強度組Kir6．2的蛋白表達非常顯著高于對照組（P＜0．01）；大強度組、中等強度組及小強度組SUR2的基因表達均顯著高于對照組（P＜0．05 或 P＜0．01），以中等強度組 SUR2 表達值最高。

3 分析與討論

圖2 各組大鼠心肌細胞KATP亞基蛋白表達。Hig：大強度組；Mid：中強度組；Low：小強度組；Con：對照組Fig 2 The expression of KATP subunits protein in different groups rat myocardial cells.

KATP屬于內向整流鉀通道超家族的一種，通道的開閉直接受到胞內[ATPi]/[ADPi]的影響，被認為是一種與細胞代謝狀態(tài)密切相關的配體門控型離子通道。KATP最早發(fā)現(xiàn)于心肌細胞[1]，隨后又陸續(xù)在平滑肌細胞、胰腺p細胞等外周細胞發(fā)現(xiàn)了KATP的表達。研究表明：KATP是由Kir和ATP結合蛋白按1∶1組成的四聚體，而組成KATP的Kir和SUR具有組織特異性。在不同組織，KATP的表達呈現(xiàn)多樣性，已有報道證實在心肌、胰腺表達的KATP亞型結構各不相同，并且通過藥理學、生物物理學手段檢測出的功能也不盡相同?，F(xiàn)在認為胰腺β細胞和大腦神經(jīng)細胞KATP由kir6.2和SUR1組成，心肌和骨骼肌KATP由kir6.2和SUR2A組成，腎臟KATP由kir1.1和CFTR組成，平滑肌KATP為Kir6.2和SUR2B組成[5~7]。KATP不僅存在于細胞膜上，也存在于線粒體膜上。1991年，INOUE在大鼠肝線粒體內膜記錄到KATP的存在，雖然mito-KATP通道亞基組成已有幾個研究小組進行了深入研究，但此通道的分子結構仍存在爭議。SUZUKI等1997年報道大鼠心肌mito-KATP含有Kir6.1[8]。2003年LACZA和SINGH的研究小組報道大鼠和小鼠心肌線粒體中有Kir6.1和Kir6.2亞基的表達[9，10]，另有研究報道，Kir6.1和Kir6.2都不是家兔和小鼠心肌細胞mito-KATP通道的組成部分[11-12]。至于磺脲類受體（SUR）亞基，2003年SINGH[10]在大鼠心肌中檢測到SUR2A，但LACZA等[12]在小鼠心肌細胞線粒體中既沒發(fā)現(xiàn)SUR1也沒發(fā)現(xiàn)SUR2，表明mito-KATP不僅有組織特異性，還有種屬特異性。DANG VAN CUONG等[13]采用熒光檢測技術和Western blot分析方法研究了大鼠心肌細胞mito-KATP的分子組成，認為mito-KATP通道亞單位包括Kir6.1、Kir6.2和SUR2，不包含SUR1?；趍ito-KATP分子組成尚沒有形成統(tǒng)一認識，所以本研究采用RTPCR技術和Western-blot技術分別在轉錄水平和翻譯水平檢測KATP四個亞基在大鼠心肌中的表達，首次探索不同強度的耐力運動對KATP各亞基表達的影響。

本研究結果顯示：無論是轉錄水平還是翻譯水平，均出現(xiàn)了Kir6.1、Kir6.2、SUR2的表達，但沒有檢測到SUR1的表達，表明大鼠心肌細胞KATP通道的亞單位為Kir6.1、Kir6.2、SUR2。結果證實了Dang Van Cuong等[13]的研究結論。另外研究發(fā)現(xiàn)：高、中、低強度的耐力運動訓練均可以促進大鼠心室肌Kir6.1、Kir6.2、SUR2的表達。有研究報道過一次性反復力竭運動對大鼠心肌Kir6.1表達的影響，結果顯示兩種運動情形下，心室肌Kir6.1的表達均顯著增加[14]，而運動對心肌KATP另兩個亞基表達的影響的研究少見報道，更沒有系統(tǒng)研究不同強度運動訓練對KATP表達影響的差異，運動訓練提高心室肌KATP亞基表達的機理也缺乏深入研究。根據(jù)本研究的結果，并結合運動訓練對心肌細胞代謝、內分泌及神經(jīng)調控的影響，推測運動可能通過下列途徑影響KATP的表達：其一，長時間耐力運動可以引起血糖水平的下降和肌糖原含量的下降，而能源底物濃度的降低可通過一些細胞內信號機制促進KATP亞基的表達[15，16]。其二，運動訓練中大鼠心臟血流動力學發(fā)生明顯改變，血流動力學的改變參與了AngⅡ表達的調節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ參與了KATP通道亞基表達的調節(jié)。AngⅡ是RAS中的一個組成成分，局部RAS調節(jié)了KATP亞基的表達[17]。其三，運動訓練中應激激素水平的升高，會通過多條途徑誘導KATP表達的增加[18]。其四，運動過程中心肌的相對缺血或絕對缺血會誘導KATP表達的增加[19]。

心肌KATP在正常生理情況下并不開放，當心肌缺血、缺氧、能量匱乏時，KATP開放以保護心肌。KATP通道的凈活力是由細胞內的KATP通道數(shù)量和開放程度決定的，運動訓練促進心肌細胞Kir6.1、Kir6.2和SUR2表達的增加，表明KATP通道表達增加，KATP活力增加，這對于提高心肌的抗缺血再灌注損傷具有重要意義[20]。KATP可能通過如下機制介導缺血預適應。（1）.減輕再灌注Ca2+超載，sarc-KATP通道開放導致細胞膜超極化，電壓依賴性慢Ca2+通道關閉，Ca2+內流減少[21]。另外sarc-KATP通道開放致K+外流，復極加速，動作電位時程縮短，平臺期內流Ca2+減少，Na+-Ca2+交換加強而排出胞質內的Ca2+。激活mito-KATP通道，進而激活 Na+／K+ATPase，減少 Na+內流和[Na+]i，減少 Na+-Ca2+交換，也能達到心肌保護的目的[22]。（2）減少心肌能量消耗。心肌細胞內Ca2+水平降低，致缺血心肌電機械活動抑制，心肌收縮力減弱，從而減少ATP的消耗[23]。（3）減少氧自由基的損傷，KATP通道可使缺血心肌的過氧化物釋放減少[24]。有研究認為，mito-KATP通道在抗自由基方面可能有一個獨立的信號傳導途徑[25-26]。（4）抑制心肌細胞凋亡。mito-KATP通道可通過影響一些凋亡調節(jié)機制達到抗凋亡的目的。mito-KATP開放，降低caspase-3及bax水平，抑制caspase-3的活化[27]?？傊?，不同強度的耐力運動訓練能不同程度引起KATP表達的增加，提高KATP的活性，從而有利于對抗缺血再灌注損傷，但不同運動引起的心臟保護作用不一定完全相同，而且KATP在介導不同運動心臟保護作用的機制也可能不相同，這些尚需進一步深入研究。

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Effect of Different Intensity Endurance Exercise Training on the Expression of ATP-sensitive Potassium Channel in Rat’s Cardiomyocytes

PENG Fenglin1，2，ZHANG Lin3，GUO Yanju1，MO Weibin1，LIAO Huiping1
（1．School of PE，Guangxi Normal University，Guilin 541004，China；2．The Key Laboratory for the Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources，Guilin 541004，China；3．School of PE，Suzhou University，Suzhou 215006，China）

Objective∶To explore the effects of different intensity endurance exercise training on the expression of ATP sensitive potassium Channel（KATP）in cardiomyocytes of rats．Methods∶40 male SD rats were randomly divided into control group （n=10），high－intensity group （n=10），moderate－intensity group（n=10）and low－intensity group（n=10）．To establish the running exercise models in rats，and detect the changes of the expression of KATP in control group and in the other three exercise groups after training by using the method of RT－PCR and Western blot．Results∶RT－PCR results showed that the gene expression of Kir6．1 in high－intensity group and the moderate－intensity group was significantly higher than control group．The gene expression of Kir6．2 in high－intensity group，the moderate－intensity group and low－intensity group was significantly higher than control group．The gene expression of SUR2 in high－intensity group，the moderate－intensity group and low－intensity group was significantly higher than control group．The gene expression of SUR1 was failed to detect in rat's cardiomyocytes．Western blot analysis was as same as PCR results，but Kir6．1 protein expression in low－intensity group was significantly higher than control group．Conclusions∶After long－time training，all intensity endurance running can increase the expression of KATP．

endurance exercise；rats；cardiomyocytes；ATP sensitive potassium channel；gene expression；protein expression

G 804．8

A

1005-0000（2012）02-093-04

2011-12-02；

2012-02-10；錄用日期：2012-02-15

國家自然科學基金項目（項目編號：31060146）；藥用資源化學與藥物分子工程教育部重點實驗室資助課題（項目編號：CMEMR2011-02）

彭峰林（1969-），男，湖南雙峰人，教授，博士，研究方向為運動適應的生物學機制。

1.廣西師范大學體育學院，廣西桂林541004；2.藥用資源化學與藥物分子工程教育部重點實驗室，廣西桂林541004；3.蘇州大學體育學院，江蘇蘇州215006。