裴 慧,錢士輝

中藥急性子為鳳仙花科 (Balsam inaceae)植物鳳仙花 (ImpatiensbalsaminaL.)的干燥成熟種子[1],中國大部分地區(qū)均有分布,資源豐富。急性子具有破血軟堅、消積的功效,其味微苦、性溫,有小毒；入肝、脾經(jīng)、降氣行瘀,主治經(jīng)閉、噎膈、腹部腫塊、骨哽咽喉和外瘍堅塊[1]；臨床上可用于避孕[2],終止早孕[3],食管賁門癌及梗阻、癌癥、腫瘤[4],閉經(jīng)和骨質(zhì)增生等[5]?，F(xiàn)代藥理學研究表明：急性子具有促透皮、抗生育、抗腫瘤及抗菌等作用。

細胞異常增殖是惡性腫瘤的生物學特征之一,檢測藥物是否影響腫瘤細胞的增殖活性通常是篩選抗腫瘤藥物的主要方法。M TT法(噻唑藍法)是最為常用的方法之一,該法靈敏度高,線性關(guān)系好,簡便、經(jīng)濟、快速,廣泛應用于大規(guī)?？鼓[瘤藥物篩選、細胞毒性實驗以及腫瘤放射敏感性測定等方面[6]。

作者以人肺癌A 549細胞株為實驗對象,對從急性子中分離得到的雙萘呋喃 -7,12-酮類化合物balsam inone A和 balsam inone B體外抑制腫瘤細胞生長的作用以及對細胞周期的影響進行研究,以期為抗腫瘤中藥的開發(fā)和臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人肺癌A 549細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。

急性子購自江蘇省盱眙縣中藥飲片廠,經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院錢士輝研究員鑒定為鳳仙花的干燥成熟種子。采用體積分數(shù) 80％和 60％乙醇加熱回流提取,并經(jīng)溶劑萃取、D 101大孔樹脂富集、硅膠柱層析、Sephadex LH-20和ODS柱層析以及重結(jié)晶等方法獲得提取物,再經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、M S、IR和UV等方法鑒定結(jié)構(gòu),并參照文獻[7]的數(shù)據(jù)鑒定提取物為balsam inone A和 balsam inone B,經(jīng) HPLC檢測純度均大于98％。臨用時用DM EM培養(yǎng)液分別配制成不同濃度備用,其中DM SO終濃度小于體積分數(shù)0.5％。

主要試劑包括：DM EM完全培養(yǎng)基(美國 GIBCO公司,批號：450542)、新生牛血清 (蘭州民海生物工程有限公司,批號：080508)、M TT(美國AMRESCO公司,批號：0793)、胰酶 (美國 AMRESCO公司,批號： 0458)、碘化吡啶(PI染液,美國 Sigm a公司)、核糖核酸酶 (美國 Sigm a公司 )、TritonX-100(美國AMRESCO公司,批號：010T0405)、DM SO(美國AMRESCO公司,批號：019D 0404)和 5-氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司,批號：0710052)。

主要儀器包括：HERA Cell 150 CO2細胞培養(yǎng)箱(美國 Thermo Fisher Scientific Inc.)、CKX31 SF倒置相差顯微鏡(日本OLYM PUS公司)、Thermo Scientific M u ltiskan Spectrum全波長酶標儀 (美國 Thermo Fisher Scientific Inc.)、MH-1403平板振蕩器 (江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)和 FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將A 549細胞接種在含體積分數(shù)10％滅活小牛血清的 DM EM完全培養(yǎng)基上,置于溫度 37℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞呈單層生長,當細胞單層面積長至培養(yǎng)瓶瓶底面積70％～80％時傳代。實驗均在細胞對數(shù)生長期進行。

1.2.2 細胞生長抑制率的測定 采用M TT法[8]測定A 549細胞的生長抑制率。取對數(shù)生長期的A 549細胞,用質(zhì)量體積分數(shù) 0.25％胰酶和質(zhì)量體積分數(shù)0.02％EDTA混合消化液消化,用含體積分數(shù) 10％滅活小牛血清的DM EM完全培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整至5×104mL-1,接種到 96孔培養(yǎng)板中,每孔 100μL細胞懸液；繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后,吸棄培養(yǎng)液；處理組分別添加含不同濃度 balsam inoneA和 balsam inoneB的培養(yǎng)液 90μL至終濃度為 20、40、60和 80μmol·L-1,陰性對照添加含 PBS的 DM EM完全培養(yǎng)基 90μL,陽性對照添加含 5-氟尿嘧啶的DM EM完全培養(yǎng)基90μL至最終質(zhì)量濃度 100m g·L-1；每處理及陰性、陽性對照均設 6個復孔,并設空白調(diào)零孔；繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔加入 5 g·L-1M TT 10μL；繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,吸棄上清液,每孔加入100μL DM SO,振蕩 10m in,溶解結(jié)晶；用酶標儀測定波長570 nm處的吸光值(A),實驗重復3次。計算A 549細胞的生長抑制率,公式為：生長抑制率 =〔(A陰性對照-A用藥)/A陰性對照〕×100％。

1.2.3 細胞周期檢測 取對數(shù)生長期的A 549細胞制成單細胞懸液,調(diào)整細胞密度至 1×105mL-1,接種于 6孔板中,每孔 2mL細胞懸液；培養(yǎng) 24 h后,處理組分別添加含不同濃度 balsam inone A和B的培養(yǎng)液2mL至終濃度為 20、40、60和 80μmol·L-1,對照組添加含體積分數(shù)10％滅活小牛血清的DM EM完全培養(yǎng)基 2mL,重復 3次；培養(yǎng) 48 h后分別收集細胞,并于 1 500 r·m in-1離心 5m in,PBS洗滌后,經(jīng) 300目尼龍網(wǎng)過濾,調(diào)整細胞密度至 1×106mL-1；加入由50mL·L-1PI和 25m g·L-1RNase A組成的染液 1 mL,4℃避光染色 30m in后采用流式細胞儀檢測,參照文獻[9]的方法分析A 549細胞的周期。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

采用 SPSS 15.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,P＜0.05表示有統(tǒng)計學差異。用M odfit軟件對熒光強度進行分析,并據(jù)此計算出DNA合成前期、DNA合成期和DNA合成后期細胞的比例。

2 結(jié)果和分析

2.1 對A549細胞的生長抑制作用

采用M TT法檢測不同濃度 balsam inone A和 B對人肺癌 A 549細胞的生長抑制作用,結(jié)果見表 1。與陰性對照組相比,20、40、60和 80μmo l·L-1balsam inone A和 B對 A 549細胞生長有顯著抑制作用 (P＜0.05),各處理組的吸光值均顯著低于陰性對照組；且隨著二者濃度的提高,對 A 549細胞的生長抑制率均呈逐漸增加的趨勢,這一作用具有明顯的量效關(guān)系。但各處理組的吸光值均大于陽性對照組(100m g·L-15-氟尿嘧啶),其中,balsam inone B各處理組的吸光值與陽性對照組有較大差異,而 20和40μmol·L-1balsam inone A處理組的吸光值與陽性對照組也有較大差異,但 60和 80μmo l·L-1balsam inone A處理組的吸光值與陽性對照組的差異較小。由生長抑制率可見：各處理組對A 549細胞的生長抑制率均低于陽性對照組,其中 20、40、60、80 μmo l·L-1balsam inone B處理組和 20、40μmo l·L-1balsam inone A處理組的生長抑制率與陽性對照組差異較大,而 60和 80μmol·L-1balsam inone A對A 549細胞的生長抑制率接近陽性對照組。

表 1 不同濃度 ba lsam inone A和 ba lsam inone B對人肺癌A549細胞的生長抑制作用(±SD)1)Tab le 1 The grow th inh ib ition effect of d ifferen t concen tra tion s of ba lsam inone A and ba lsam inone B on hum an lung cancer A 549 cell (±SD)1)

表 1 不同濃度 ba lsam inone A和 ba lsam inone B對人肺癌A549細胞的生長抑制作用(±SD)1)Tab le 1 The grow th inh ib ition effect of d ifferen t concen tra tion s of ba lsam inone A and ba lsam inone B on hum an lung cancer A 549 cell (±SD)1)

1)CK1：陰性對照 Negative contro l；CK2：陽性對照 (100m g·L-1 5 -氟尿嘧啶)Positive con tro l(100m g·L-1 5-FU).＊：與陰性對照相比差異顯著 (P＜0.05)Significant difference compared w ith the negative control(P＜0.05).

處理Treatment濃度/μmo l·L-1 Concentration A570生長抑制率/％ Grow th inhibition rate CK1 - 1.379±0.701 -CK2 - 0.305±0.026＊ 77.882 Balsam inone A 20 0.692±0.043＊ 49.819 40 0.423±0.036＊ 69.326 60 0.351±0.008＊ 74.547 80 0.328±0.041＊ 76.215 Balsam inone B 20 0.617±0.053＊ 55.257 40 0.605±0.031＊ 56.128 60 0.551±0.007＊ 60.044 80 0.532±0.020＊ 61.421

2.2 對A549細胞周期分布的影響

人肺癌A 549細胞的細胞周期特點是細胞群分布于細胞的各個時期。經(jīng)不同濃度 balsam inone A和B處理后A 549細胞各時期的比例見表 2。

表 2 不同濃度 ba lsam inone A和 ba lsam inone B對人肺癌 A 549細胞周期分布的影響(±SD)1)Tab le 2 Effectsof d ifferen t concen tra tions of ba lsam inone A and ba lsam inone B on d istr ibu tion of cycle of hum an lung cancer A 549 cell(± SD)1)

表 2 不同濃度 ba lsam inone A和 ba lsam inone B對人肺癌 A 549細胞周期分布的影響(±SD)1)Tab le 2 Effectsof d ifferen t concen tra tions of ba lsam inone A and ba lsam inone B on d istr ibu tion of cycle of hum an lung cancer A 549 cell(± SD)1)

1)G0/G1：DNA合成前期 DNA p resynthesisphase；S：DNA合成期DNA synthesisphase；G2/M：DNA合成后期DNA postsynthesisphase.＊：與各自的對照相比差異顯著(P＜0.05)Significantdifference compared w ith the respective control(P＜0.05).

處理Treatm en t濃度/μmol·L-1 Concentration比例/％ Proportion G0/G1 S G2/M對照CK - 82.393±1.764 13.108±1.255 4.498±0.592 Balsam inone A 20 75.785±3.696＊ 17.483±2.411 6.733±1.366 40 74.427±6.014＊ 17.750±4.627＊ 7.820±2.415＊60 74.485±4.466＊ 18.553±2.809＊ 6.960±2.312 80 74.380±6.226＊ 16.713±3.740 8.905±2.573＊對照CK - 82.091±2.015 14.152±2.698 3.753±2.797 Balsam inone B 20 78.643±2.393 17.903±0.080＊ 3.913±2.800 40 77.493±2.955 19.090±0.635＊ 3.417±2.503 60 75.467±3.147＊ 20.713±1.832＊ 3.863±1.386 80 74.740±2.681＊ 21.417±1.381＊ 3.843±1.519

20、40、60和 80μmol·L-1balsam inone A作用于A 549細胞 48 h后,各處理組 DNA合成前期 (G0/G1期)的細胞比例均較對照顯著減少 (P＜0.05)；DNA合成期 (S期)的細胞比例均較對照有所增加,其中, 40和 60μmo l·L-1balsam inone A處理組與對照差異顯著；DNA合成后期(G2/M期)的細胞比例也均較對照有所增加,其中,40和 80μmo l·L-1balsam inone A處理組與對照差異顯著。研究結(jié)果表明：balsam inone A作用于A 549細胞,但無明顯的量效關(guān)系。

20、40、60和 80μmo l·L-1balsam inone B作用于A 549細胞 48 h后,各處理組 G0/G1期的細胞比例均較對照減少,其中,60和 80μmo l·L-1balsam inone B處理組與對照差異顯著；S期的細胞比例均較對照顯著增加；各處理組 G2/M期的細胞比例與對照差異不大,但 20、60和 80μmo l·L-1balsam inone B處理組較對照小幅增加,而 40μmo l·L-1balsam inone B處理組較對照小幅減少。研究結(jié)果表明：balsam inone B作用于A 549細胞的 G0/G1期和 S期,且有明顯的量效關(guān)系。

3 討 論

惡性腫瘤細胞異常增殖是其生物學特征之一,而腫瘤的發(fā)生是細胞增殖與細胞凋亡相互拮抗的最終結(jié)果,由于細胞凋亡的存在,拮抗了細胞的加速增殖,維持細胞自身穩(wěn)定,在臨床上常通過各種方法和手段誘發(fā)腫瘤細胞發(fā)生凋亡,從而達到治療腫瘤目的。

本文的研究結(jié)果表明：從急性子中分離得到的balsam inone A和 balsam inone B對人肺癌 A 549細胞的生長均具有較為顯著的抑制作用,其生長抑制率隨2個化合物濃度的提高而增強,具有明顯的量效關(guān)系。但這 2個化合物對A 549細胞生長的抑制作用低于常用的藥物 5-氟尿嘧啶,推測其原因與化合物濃度、抑制作用的機制等多種因素有關(guān),有待進一步的研究證實。

供試的 2個化合物對人肺癌A 549細胞周期均有影響。balsam inone A能導致 A 549細胞DNA合成前期(G0/G1期)的細胞比例減少、DNA合成期(S期)和DNA合成后期 (G2/M期)的細胞比例增加,說明balsam inone A主要是將人肺癌A 549細胞的生長周期阻滯在 S期和 G2/M期,從而抑制 A 549細胞生長。balsam inone B則能導致A 549細胞中 G0/G1期的細胞比例減少、S期的細胞比例增加,且這一作用具有明顯的量效關(guān)系,而對 G2/M期細胞則無明顯作用,說明balsam inone B主要是將A 549細胞的生長周期阻滯在S期,阻止細胞進入 G2/M期,從而抑制 A 549細胞的生長。推測這 2個化合物對人肺癌A 549細胞不同的作用機制可能與 balsam inone A結(jié)構(gòu)中包含羥基而balsam inone B結(jié)構(gòu)中包含葡萄糖苷基有關(guān)。balsam inoneA和B對A 549細胞周期的影響機制可能是影響細胞周期蛋白的合成,也可能是通過其他途徑影響基因表達,其作用機制還有待進一步研究。

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