許凱揚(yáng) 熊詩(shī)璇 陳 璇 祁 娟 王文龍

（長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114）

蘋(píng)果果醋加工過(guò)程的發(fā)酵工藝研究

許凱揚(yáng) 熊詩(shī)璇 陳 璇 祁 娟 王文龍

（長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114）

運(yùn)用正交試驗(yàn)方法對(duì)蘋(píng)果果醋加工工藝中粟酒裂殖酵母降酸、酒精發(fā)酵及醋酸發(fā)酵等方面進(jìn)行研究。結(jié)果表明，生物降酸最佳條件：溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間3d，粟酒裂殖酵母接種量為5%；酒精發(fā)酵最佳條件：溫度26℃，發(fā)酵時(shí)間7d，釀酒酵母接種量為5%；醋酸發(fā)酵最佳條件：初始酒精度7%，發(fā)酵時(shí)間20d，醋酸菌接種量10%，發(fā)酵溫度為32℃。

蘋(píng)果果醋；降酸；酒精發(fā)酵；醋酸發(fā)酵

果醋是集營(yíng)養(yǎng)、保健、食療等功能于一體的新型飲品。蘋(píng)果醋具有防止動(dòng)脈硬化和降血壓、促進(jìn)腸胃消化、增強(qiáng)食欲、防止腸胃疾病、消除或減輕疲勞的功效［1－2］，具有巨大市場(chǎng)發(fā)展?jié)摿烷_(kāi)發(fā)前景。

蘋(píng)果含有一定的蘋(píng)果酸，殘留在蘋(píng)果醋中會(huì)影響成品果醋的口感和品質(zhì)，一般都要設(shè)法去除。目前中國(guó)降酸的方法多以化學(xué)降酸、物理降酸為主，化學(xué)降酸方法包括酸堿中和、離子交換等；物理降酸包括膜分離、電滲析等［3］。這兩種方法對(duì)酒質(zhì)的負(fù)面影響較大，使用不當(dāng)有可能引起果酒瓶?jī)?nèi)發(fā)酵。中國(guó)國(guó)內(nèi)近年來(lái)對(duì)果醋生物降酸的研究較少且進(jìn)展緩慢。國(guó)外在對(duì)果醋降酸研究和發(fā)展方向主要是微生物降酸法，這些微生物包括能夠進(jìn)行蘋(píng)果酸－乳酸發(fā)酵的乳酸菌和能夠進(jìn)行蘋(píng)果酸－酒精發(fā)酵的裂殖酵母。同時(shí)，隨著現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)的發(fā)展，如固定化細(xì)胞（酶）技術(shù)的應(yīng)用，生物反應(yīng)器的開(kāi)發(fā)已使果酒的微生物降酸技術(shù)朝著更可控、易操作的方向發(fā)展［4］。

粟酒裂殖酵母 （schizosaccharomyces pombe）屬于裂殖酵母屬，可進(jìn)行蘋(píng)果酸－乙醇發(fā)酵，即在厭氧條件下分解蘋(píng)果酸生成乙醇和CO2［5］。本試驗(yàn)以紅富士蘋(píng)果為原料，采用粟酒裂殖酵母對(duì)蘋(píng)果汁進(jìn)行生物降酸、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵的工藝條件進(jìn)行探討，確定蘋(píng)果果醋的生產(chǎn)工藝最佳試驗(yàn)條件，為提升蘋(píng)果果醋工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紅富士蘋(píng)果，釀酒酵母：市售；

粟酒裂殖酵母：廣東省微生物研究所；

醋酸菌：滬釀1.01，廣東省微生物研究所；

粟酒裂殖酵母活化培養(yǎng)基：麥芽浸膏3g，葡萄糖10g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g，瓊脂20g，水1 000mL；

醋酸菌分離培養(yǎng)基：酵母膏1g，葡萄糖1g，瓊脂2g，水100mL，0.1MPa滅菌30min，滅菌后加入 CaCO32g，95%酒精2mL，冷卻后，制成平板CaCO3分離培養(yǎng)基；

醋酸菌擴(kuò)培培養(yǎng)基：殺菌后的發(fā)酵果汁；

檸檬酸、果膠酶、酵母浸膏、瓊脂粉、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉、碳酸鈣：均為市售分析純。

1.2 工藝流程

新鮮成熟蘋(píng)果→ 挑選→ 清洗→ 破碎→ 浸泡→ 榨汁→酶解→ 滅酶→ 澄清過(guò)濾→滅菌→ 降酸→ 調(diào)整糖度→ 酒精發(fā)酵（酵母菌）→ 醋酸發(fā)酵（醋酸菌）→ 澄清過(guò)濾→ 調(diào)配→精濾、殺菌→蘋(píng)果醋飲料

1.3 操作要點(diǎn)

1.3.1 原料處理 將洗凈的蘋(píng)果切成1cm厚的果塊，放入pH 4.0的檸檬酸溶液中浸泡5min。酶解過(guò)程加入0.01%的果膠酶，酶解時(shí)間2h，酶解溫度45℃，85℃滅酶。

1.3.2 生物降酸 將粟酒裂殖酵母進(jìn)行活化擴(kuò)培，通過(guò)鏡檢得菌數(shù)為7.00×106個(gè)/mL，將活化擴(kuò)培后的粟酒裂殖酵母按3%，4%，5%的接種量分別接入100mL蘋(píng)果汁中。發(fā)酵溫度分別為26，28，30℃；發(fā)酵時(shí)間分別為1，2，3d，并對(duì)蘋(píng)果酸減少量進(jìn)行測(cè)量。

1.3.3 酒精發(fā)酵 經(jīng)過(guò)三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的酵母菌接種于已經(jīng)降酸處理且調(diào)整好成分的果汁中，每天觀察發(fā)酵現(xiàn)象，并采用比重法測(cè)量酒精度。

1.3.4 醋酸發(fā)酵 經(jīng)過(guò)三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的醋酸菌接種于酒精發(fā)酵液中，并定期檢查發(fā)酵液溫度，每隔2d測(cè)定發(fā)酵液中酸度1次。

1.4 檢測(cè)方法

（1）總酸（以醋酸計(jì)）含量的測(cè)定：酸堿滴定法［6］；

（2）蘋(píng)果酸含量的測(cè)定：酸堿滴定法；

（3）總糖含量的測(cè)定：手持糖度計(jì)；

（4）酒精含量的測(cè)定：比重法［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 粟酒裂殖酵母生物降酸發(fā)酵條件的確定

蘋(píng)果果醋加工工藝中采用的生物降酸除受菌種種類的影響外，還受到菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等因素的影響。本試驗(yàn)通過(guò)前期單因素試驗(yàn)確定正交試驗(yàn)因素與水平取值（見(jiàn)表1），以發(fā)酵后蘋(píng)果酸的減少量為考察指標(biāo)，采用L9（33）正交試驗(yàn)來(lái)確定粟酒裂殖酵母生物降酸過(guò)程的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 降酸正交試驗(yàn)因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment of acid－degradation

由表2可知，粟酒裂殖酵母降解蘋(píng)果酸中的影響因素依次為B＞C＞A，最優(yōu)因素水平組合為A3B2C3，即接種量5%，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵3d的組合降酸效果最為明顯。對(duì)A3B2C3組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得蘋(píng)果酸減少量為19.58%，高于正交試驗(yàn)中的所有因素水平組合，進(jìn)一步證實(shí)該組合降酸效果最佳。

2.2 酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)

蘋(píng)果果醋酒精發(fā)酵除受菌種種類的影響外，還受到發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、菌種接種量等因素的影響。本試驗(yàn)通過(guò)前期單因素試驗(yàn)確定了正交試驗(yàn)因素與水平取值（見(jiàn)表3），以發(fā)酵液的酒精含量為考察指標(biāo)，采用L9（33）正交試驗(yàn)來(lái)確定酒精發(fā)酵過(guò)程的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 降酸正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment of acid－degradation

由表4可知，釀酒酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中的影響因素依次為A＞B＞C，最優(yōu)因素水平組合為A3B2C3，即發(fā)酵溫度26℃，發(fā)酵7d，接種量5%的組合酒精度最高。對(duì)A3B2C3組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得發(fā)酵液中酒精含量為8.78%，高于正交試驗(yàn)中的所有因素水平組合，進(jìn)一步證實(shí)該組合酒精發(fā)酵效果最佳。

2.3 醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)

果醋醋酸發(fā)酵除受菌種種類的影響外，還受到發(fā)酵初始酒精度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、菌種接種量等因素的影響。酒精是醋酸菌繁殖代謝的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此酒精度的提高在一定程度上能促進(jìn)醋酸發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸量的提高，但醋酸菌的生長(zhǎng)和代謝也會(huì)因酒精濃度過(guò)高受到抑制，致使產(chǎn)酸量下降，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，所以醋酸發(fā)酵的酒精度要控制在一定范圍內(nèi)。本試驗(yàn)以醋酸菌接種量、初始酒精度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為因素，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定正交試驗(yàn)因素水平取值（見(jiàn)表5），以發(fā)酵液的酸度為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)來(lái)確定醋酸發(fā)酵過(guò)程的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of orthogonal experiment of alcoholic fermentation

表5 醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)因素水平表Table 5 The factors and levels of orthogonal experiment of acetic fermentation

表6 醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 The results of orthogonal experiment of acetic fermentation

由表6可知，醋酸菌發(fā)酵過(guò)程中的影響因素依次為B＞D＞A＞C，最優(yōu)因素水平組合為A2B3C2D1。即接種量10%，初始酒精度7%，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵20d的組合酸度最高。對(duì)A2B3C2D1組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得酒精醪液中酸度為4.08%，高于正交試驗(yàn)中的所有因素水平組合，進(jìn)一步證實(shí)了該組合酒精發(fā)酵效果最佳。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)發(fā)酵液中蘋(píng)果酸減少量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其中發(fā)酵溫度是影響粟酒裂殖酵母對(duì)蘋(píng)果酸分解的最大因素，它直接影響者粟酒裂殖酵母的繁殖力和發(fā)酵力。本試驗(yàn)利用粟酒裂殖酵母來(lái)分解蘋(píng)果酸，與利用乳酸菌進(jìn)行蘋(píng)果酸－乳酸發(fā)酵降酸的方法相比，該技術(shù)具有降酸效果明顯、對(duì)果醋品質(zhì)不產(chǎn)生負(fù)面影響、可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)。隨著發(fā)酵過(guò)程中酒精的溫度的升高酒精發(fā)酵速度也加快，但發(fā)酵速度越快，酵母菌的疲勞現(xiàn)象出現(xiàn)越早，且發(fā)酵時(shí)間短，發(fā)酵不完全，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)溶液中含糖量較低，酵母發(fā)酵效率下降，感染雜菌的幾率又會(huì)增加。除本試驗(yàn)中提到的各種影響蘋(píng)果果醋加工工藝的因素外，性能優(yōu)良的菌種也是保證果醋產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的關(guān)鍵。本試驗(yàn)采用滬釀1.01號(hào)醋酸菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵，發(fā)酵后原醋的醋酸含量為4.08%～4.26%，風(fēng)味優(yōu)良。建議選用多種醋酸菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵作進(jìn)一步的研究，以選育出更佳適合蘋(píng)果醋酸發(fā)酵的菌種。

1 陳春香.蘋(píng)果醋的功能和工藝探討［J］.中國(guó)調(diào)味品，2007（10）：65～74.

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Study on fermentation of production process of apple vinegar

XU Kai－yang XIONG Shi－Xuan CHEN Xuan QI JuanWANG Wen－long

（School of Chemistry and Biological Engineering，Changsha University of Science ＆Technology，Changsha，Hunan410114，China）

Acid－degradation ofSchizosaccharomyces pombe，alcoholic fermentation and acetic fermentation were researched in the processing of apple vinegar by applying orthogonal experiment.The optimal acid decreasing condition were as follows：5%inoculation of fermentation，fermentation temperature 28℃，fermentation time 3d.The optimized parameters of alcoholic fermentation were：5%inoculation of yeast，fermentation temperature 26 ℃，fermentation time 7d.The optimized parameters of acetic fermentation was 10%inoculation at 32℃for 20d，7%incipient alcoholicity.

apple vinegar；acid－degradation；alcoholic fermentation；acetic fermentation

10.3969/j.issn.1003－5788.2011.03.040

研究性學(xué)習(xí)與創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目；湖南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：2009GK3024）

許凱揚(yáng)（1972－）男，長(zhǎng)沙理工大學(xué)副教授，博士。E－mail：xukaiyang＠scbg.ac.cn

2011－03－10