李玉明張少華

（1.衡陽師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)系，湖南 衡陽 421008；2.衡陽師范學(xué)院功能金屬有機材料湖南省普通高等學(xué)校重點實驗室，湖南 衡陽 421008）

新型高效液相色譜法分析淮山中的VB1

李玉明1，2張少華1，2

（1.衡陽師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)系，湖南 衡陽 421008；2.衡陽師范學(xué)院功能金屬有機材料湖南省普通高等學(xué)校重點實驗室，湖南 衡陽 421008）

采用超聲波提取法從新鮮淮山中提取VB1，研究高效液相色譜法分析淮山中VB1的最佳分析條件。結(jié)果表明：以甲醇∶純水＝5∶5為流動相，流動相的流速1.0mL/min，紫外檢測波長265nm，柱溫在25℃為淮山中VB1的最佳高效液相色譜分析條件，其標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2＝0.998 9。在此條件下VB1的平均回收率為97.3%，重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.8%；測得淮山中VB1的含量為3.8mg/100g。所建立的方法簡單、快速、準(zhǔn)確度高。

淮山；VB1；提??；高效液相色譜法；分析

淮山既是一味重要的中藥，又是一種常見的蔬菜?；瓷綁K莖含有大量的淀粉、蛋白質(zhì)、尿囊素、維生素、糖類及人體必需的10多種氨基酸［1］，其中VB1的含量約3～5mg/100g。淮山不僅營養(yǎng)豐富，而且具有很高的藥用價值［2］，在防止高血脂及調(diào)整胃腸功能方面有較好療效，還能降低血糖及提高或調(diào)節(jié)免疫功能，具有抗衰老作用。

維生素B1（VB1）為抗神經(jīng)炎維生素，是人體生長和發(fā)育不可或缺的重要營養(yǎng)元素，是機體維持正常代謝和機能所必需的低分子有機化合物之一［3－4］。VB1的提取方法有酸解提取、水飽和正丁醇－表面活性劑萃取、超聲波提取等方法。VB1的主要分析方法有：紫外分光光度法、熒光法、電化學(xué)法、偶氮染料比色法和高效液相色譜法（HPLC）等方法［5］。由于VB1本身沒有熒光，必須先將其氧化為硫色素才能進(jìn)行熒光測定，操作要求非常嚴(yán)格，才能獲得較滿意的結(jié)果，故熒光法不適于分析淮山中的VB1含量。紫外分光光度法與偶氮染料比色法主要用于測定雜質(zhì)含量較少的樣品，且精密度不高，也不適用于分析淮山提取液。同上述其他分離技術(shù)相比，高效液相色譜法（HPLC）在 VB1分析中有重要優(yōu)勢［6－7］，其操作簡便，專屬性強，線性關(guān)系和精密度更好，結(jié)果更準(zhǔn)確，可以更方便有效地分析淮山中的VB1。本試驗擬采用一種新型的高效液相色譜法，與文獻(xiàn)［4］的HPLC相比較，其流動相組成更簡單，檢測波長不同，流速較低，柱溫較低。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（shim pack VP－ODS柱150mm×6.0mm）：LC－10Avp，日本島津公司；

紫外－可見分光光度儀：UV2501，日本島津公司；

超聲波脫氣裝置：AS3120，奧特賽恩斯儀器公司；

真空抽濾裝置：AP－01，奧特賽恩斯儀器公司；

電子分析天平：AE240，梅特勒－托利多公司；

臺式高速離心機：TG1－16GA，湖南星科科學(xué)儀器有限公司；

甲醇：色譜純，天津巴斯夫化工廠；

VB1：分析純，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；

草酸：分析純，沈陽醫(yī)藥公司；

純水：實驗室自制；

淮山：市售。

1.2 試驗前處理

1.2.1 流動相的制備 稱取1.000g的草酸溶于2 000mL純水中，搖勻，用0.45μm微孔濾膜真空抽濾，以40kHz的超聲頻率超聲波脫氣30min，待用。將甲醇與含0.5‰ 草酸的純水按不同體積比分別混合，超聲波脫氣，作為流動相，待用。

1.2.2 標(biāo)液的制備 稱取一定量的VB1標(biāo)準(zhǔn)品，用純水溶解，配制濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10mg/mL的VB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.45μm微孔濾膜真空抽濾，以頻率為40kHz的超聲波脫氣10min，放置在避光處備用。

1.2.3 樣品溶液的制備 稱取新鮮淮山50g榨汁，榨汁后的汁液和渣中加入一定量的純水和50mL甲醇，于室溫下以60kHz的超聲頻率超聲波提取60min，過濾，再將汁液高速離心20min，取其清液，再用0.45μm微孔濾膜抽濾，然后將濾液倒入100mL的容量瓶里，定容，以頻率為40kHz的超聲波脫氣15min，作為樣品溶液，待用。

1.3 試驗方法

設(shè)置液相色譜儀各條件，用流動相走基線，待基線平穩(wěn)后，取10μL系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，測出峰面積，得出線性回歸方程，比較出峰情況和回歸方程，確定最佳分析條件［8－9］。然后進(jìn)行淮山樣品的含量、重復(fù)性、回收率分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

以純水與甲醇比例為5∶5作流動相，VB1的濃度為0.06mg/mL，流速為1.0mL/min，柱溫為25℃的條件下分別在245，255，265，275，285nm等一系列波長處對標(biāo)液進(jìn)行測定，結(jié)果顯示在波長265nm處峰面積最大（見表1），吸收峰最高，波形最好。因此，確定以265nm作為VB1的檢測波長。

表1 VB1檢測波長與峰面積關(guān)系表Table 1 The table of VB1peak area with wavelength

2.2 最佳分析條件的確定和樣品測定

在檢測波長為265nm，流動相速度為1.0mL/min，柱溫為25℃下用不同流動相分析VB1標(biāo)液，測出其峰面積，作峰面積－濃度回歸曲線，得出線性回歸方程。以甲醇∶純水＝5∶5的混合液做流動相時，其回歸曲線（見圖1）的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2＝0.998 9，回歸線方程為：y＝2×107x－162 208。通過比較峰形、半峰寬及線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2的大小，發(fā)現(xiàn)以甲醇∶純水＝5∶5的混合液做流動相時其色譜峰（見圖2）峰形更好、峰高更高、半峰寬較窄，說明此條件下出峰情況最好；其線性相關(guān)系數(shù)R2值最大，更接近1，說明此條件下曲線相關(guān)性最好。因此，得出分析淮山中VB1含量的最佳條件為流動相為甲醇∶水＝5∶5的混合液，檢測波長為265nm，流動相速度為1.0mL/min，柱溫為25℃。該條件下，測得淮山樣品溶液的VB1質(zhì)量濃度為0.019mg/mL，則淮山中 VB1的含量為3.8mg/100g。

圖1 最佳條件下VB1標(biāo)液濃度與峰面積的回歸曲線Figure 1 The regression curve of vitamin B1standard solution concentration with peak area under the best conditions

圖2 最佳條件下VB1標(biāo)液色譜圖Figure 2 The HPLC of standard sample of vitamin B1under the optimum HPLC conditions

2.3 VB1穩(wěn)定性試驗

將濃度為0.06mg/mL的VB1標(biāo)液，在室溫下分別存放0，2，4，6，8，10h，各取10μL在最佳分析條件下測其峰面積，計算保存率，分析其穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。

由表2可見，VB1的峰面積在10h內(nèi)基本沒有明顯變化，保存率達(dá)97%以上，性質(zhì)較穩(wěn)定。

表2 VB1穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)表Table 2 The VB1stability experiment data table

2.4 重復(fù)性試驗

取10μL處理好的淮山樣品進(jìn)樣，重復(fù)測定6次，測定各次的峰面積，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。試驗測得淮山樣品峰面積分別為：229 853、240 306、220 613、235 470、220 080、211 263，峰面積平均值為226 264，標(biāo)準(zhǔn)偏差為10 862，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.8%。結(jié)果表明：此高效液相色譜分析方法重復(fù)性的精密度高，重復(fù)性好，方法可靠。

2.5 回收試驗

分別將 VB1標(biāo)準(zhǔn)品0.20，0.40，0.45，0.50，0.60mg添加于各裝有5mL淮山樣品溶液的燒杯中，用純水溶解，再分別轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶，定容，超聲波脫氣。吸取10μL進(jìn)樣，結(jié)果見表3。

表3 樣品回收率試驗結(jié)果Table 3 The sample recovery experiment data table

試驗所得的回收率平均值為97.3%，明顯高于文獻(xiàn)［4］中回收率88%～92%，說明該方法的定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確度高，能準(zhǔn)確測定出淮山中VB1的含量。

3 結(jié)論

（1）室溫下VB1性質(zhì)較穩(wěn)定，以甲醇和水作溶劑，通過超聲波從新鮮淮山中提取VB1的方法，簡便高效。

（2）本試驗采用的新型高效液相色譜法，與文獻(xiàn)［4］中的HPLC分析VB1相比較，其流動相組成更簡單，流速更低，柱溫更低，檢測波長不同，而VB1回收率更高。其原因可能是溫度低，有利于VB1的穩(wěn)定；VB1在波長265nm處對紫外光的吸收比文獻(xiàn)［4］中的238nm處更大。因此，此法較適宜于VB1的分析。

1 韋本輝，甘秀芹，韋威泰.淮山生食性研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（1）：317～318.

2 王昭晶，羅巔輝，蔡婀娜.淮山水溶性多糖的提取與高效液相色譜分離的研究［J］.漳州師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，53（3）：76～81.

3 王莉，周光明，鄧傳躍.反相高效液相色譜－增敏化學(xué)發(fā)光同時測定 VB1和 VC［J］.分析科學(xué)學(xué)報，2006，22（5）：533～535.

4 肖冬光，畢琳，韓英素.反相高效液相色譜法檢測酵母胞內(nèi)VB1含量［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（10）：120～121.

5 劉娜.食品中水溶性維生素B分析方法的研究［D］.北京：北京化工大學(xué)，2008：114～115.

6 Pilar V，Carmen L.Reversed－phase liquid chromatography on an amide stationary phase for the determination of the B group vitamins in baby food［J］.Journal of Chromatography A，2003，（1 007）：77～84.

7 謝玥，賈麗，焦玉海.高效液相色譜法測定蔬菜中B族維生素［J］.中國食品添加劑，2010（3）：218～220.

8 許金生，于慧芳，包曉玉.儀器分析［M］.南京：南京大學(xué)出版社，2004：297～300.

9 于世林.高效液相色譜方法及應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：30～34.

A new analysis of VB1in Chinese yam by high performance liquid chromatography

LI Yu－ming1，2ZHANG Shao－h(huán)ua1，2

（1.Department of Chemistry and Material Science，Hengyang Normal University，Hengyang，Hunan421008，China；2.Key Laboratory of Functional Organometallic Materials of Hengyang Normal University，College of Hunan Province，Hengyang，Hunan421008，China）

The VB1was extracted from fresh Chinese yam by ultrasonic extraction method，and the optimum HPLC conditions of VB1in the Chinese yam were explored.A large number of experimental studies showed that the methanol∶water＝5∶5as mobile phase，mobile phase flow rate at 1.0mL/min，UV detection at 265nm，column temperature at 25℃was the optimum HPLC conditions of VB1in the Chinese yam，the established standard curve had good linear relationship，the correlation coefficientR2＝0.998 9.Under these conditions，the average recovery of VB1was 97.3%，relative standard deviation of the method precision less than 4.8%；the content of VB1in the Chinese yam was 3.8mg/100g.The method is a simple，fast，accurate and suitable for the analysis of VB1in the Chinese yam.

Chinese yam；VB1；extraction；high performance liquid chromatography（HPLC）；analysis

10.3969/j.issn.1003－5788.2011.03.022

衡陽市科技計劃項目（編號：2010kn17）

李玉明（1978－），男，衡陽師范學(xué)院講師，碩士。E－mail：luck53681＠sina.com

2011－03－10