徐春秀

（韓山師范學院化學系，廣東潮州 521041）

芯片上的流動注射分析

徐春秀

（韓山師范學院化學系，廣東潮州 521041）

流動注射分析（Flow injection analysis,FIA）打破了分析化學必須在物理化學平衡條件下進行的傳統(tǒng)，具有廣泛的適應性、高效率、低消耗、重現(xiàn)性好及自動化程度高等優(yōu)點．目前異軍突起的微型全分析系統(tǒng)為流動注射分析理論與技術的發(fā)展注入了新的動力．本文總結(jié)了十余年來在微流控分析芯片上進行流動注射分析操作的方法與技術，對各種方法的優(yōu)缺點進行了比較和分析．

微流控芯片；流動注射分析；微型全分析系統(tǒng)

流動注射分析是指“將一定體積的試樣溶液注射到載流溶液中，試樣區(qū)帶在流動的載流中經(jīng)過受控制的分散，由流通式檢測器檢測其連續(xù)變化的物理或化學信號的方法”[1]．流動注射分析方法具有適應性廣、效率高、消耗低、重現(xiàn)性好、自動化程度高等優(yōu)點．自Ruzicka和Hansen[2]在1975年首次提出后，流動注射分析立刻引起了世界上分析化學家的廣泛關注，目前關于流動注射分析的理論日益完善，與各種分離分析技術的聯(lián)用已非常成熟．流動注射分析法因其擺脫了幾百年來分析化學反應必須在物理化學平衡條件下完成的傳統(tǒng)，在分析化學的發(fā)展史上占有重要地位.

20世紀90年代，異軍突起的微型全分析系統(tǒng)（miniaturized total analysis system,μTAS）成為分析化學領域廣受矚目的焦點，引發(fā)了分析化學的又一次巨大變革．微型全分析系統(tǒng)由Manz和Widmer[3]于上世紀90年代初提出，目標是將分析化學實驗室的多個功能單元如樣品引入、預處理、反應、分離與檢測等集成在一枚數(shù)平方厘米大小的微芯片上，實現(xiàn)分析系統(tǒng)的微型化、集成化、便攜化與自動化.微流控芯片具有極高的分離分析效率（數(shù)秒至數(shù)十秒內(nèi)完成分離、測定或其他更復雜的操作）、極低的樣品與試劑消耗（樣品與試劑消耗可降至納升至皮升）等優(yōu)越性．但是，微流控芯片分析中的進樣量僅為納升至皮升，與外部微升至毫升級的宏觀系統(tǒng)之間的銜接是微流控芯片分析面臨的一大挑戰(zhàn)．其次，在微流控芯片分析中進行快速、高效的換樣操作仍舊是具有較高的難度，這大大限制了微流控芯片的高速、高效的潛力[4]．微流控分析芯片存在的諸多問題和挑戰(zhàn)為流動注射在微流控芯片分析領域的發(fā)展提供了機會．針對以上問題，學者們提出了多種在微流控芯片上進行流動注射操作的方法，目前報道的主要有外接常規(guī)泵閥的方法、電滲驅(qū)動的方法、芯片上集成微泵微閥的方法、基于取樣探針的方法、基于液滴注射的方法等.

1 基于微流控芯片的流動注射分析

1.1 外接常規(guī)流動注射泵閥的方法

2002年，方群等[5]用常規(guī)流動注射蠕動泵將宏觀體系中的樣品引入一自制的溢流式芯片接口，在樣品池接口與樣品廢液池之間施加電壓使樣品流向廢液池，然后在緩沖液池和緩沖廢液池之間施加電壓使通道交叉口的樣品引入至分離通道進行電泳分離．該系統(tǒng)用于氨基酸樣品的分離分析，分析速度可達40-80樣/小時．黃艷貞等[6]又結(jié)合蠕動泵和重力驅(qū)動的方法，采用流動注射的模式實現(xiàn)了快速換樣操作．如圖1[6]所示，芯片垂直放置，利用芯片上儲液池和廢液池之間的液位差，使發(fā)光試劑魯米諾與鐵氰化鉀流入芯片通道匯合，過氧化氫樣品則通過蠕動泵驅(qū)動使其流入芯片通道與魯米諾與鐵氰化鉀的混合物匯合反應后經(jīng)光子計數(shù)器檢測．

2007年，Amatatongchai等[7]采用外接注射泵與切換閥的方法實現(xiàn)了基于微流控芯片的流動注射化學發(fā)光分析．如圖2[7]所示，過氧化物酶、染料和催化劑等混合物與過氧化氫由外接注射泵驅(qū)動連續(xù)引入芯片微通道，抗氧化劑樣品由一個50μL外接切換閥定量注射引入，反應產(chǎn)物由倒置熒光顯微鏡檢測．

1.2 電滲驅(qū)動流動注射分析

外接常規(guī)流動注射分析蠕動泵或注射泵和閥進行芯片分析系統(tǒng)的流動注射操作具有換樣操作快、分析通量高等優(yōu)點，但是微升至毫升級的外部宏觀系統(tǒng)與納升至皮升級的微觀芯片分析系統(tǒng)的銜接常導致死體積和樣品消耗量過大的問題，體積龐大的泵閥也給微流控芯片分析系統(tǒng)的集成化和微型化帶來困難．采用電滲驅(qū)動的方法則可在芯片上實現(xiàn)無泵無閥的流動注射操作[8-15].

自1995年開始，Haswell研究組報道了一系列采用電滲驅(qū)動在微流控芯片上進行流動注射操作的方法[8-11]．如圖3[11]所示，在試劑池（R）和廢液池（W）之間施加電壓30 s，試劑由試劑池流向廢液池并充滿主通道，然后在樣品池（S）和廢液池（W）之間施加電壓，樣品池中的樣品注射進入主通道試劑溶液中，最后在試劑池（R）和廢液池（W）之間施加電壓將樣品區(qū)帶推至檢測器檢測.Ramsey[12]研究組利用電滲驅(qū)動芯片流動注射的方法研究了0-200 nmol/L的Tarine對乙酰膽堿酯酶的抑制分析.

圖1 結(jié)合蠕動泵和重力驅(qū)動的FIA系統(tǒng)

圖2 芯片F(xiàn)IA系統(tǒng)流路與芯片實物

圖3 電滲驅(qū)動FIA分析示意圖

電滲驅(qū)動流動注射的優(yōu)點是使用高壓電源系統(tǒng)實現(xiàn)液流的操控，無需外置泵閥，有利于微流控芯片分析系統(tǒng)的微型化與便攜化，但是電滲驅(qū)動易導致電動進樣過程中的歧視效應.

1.3 打破流體驅(qū)動力平衡-從層流到注射

在芯片流動注射分析發(fā)展過程中，有學者報道了一種采用改變流體驅(qū)動力實現(xiàn)流動注射分析的方法.2007年，Moehlenbrock等[16]使用兩個常規(guī)的微量注射泵將試劑和樣品輸入芯片通道，試劑和樣品在微通道內(nèi)以層流狀態(tài)流動并流入各自廢液池．裝樣時，將六通閥由裝樣調(diào)為注樣狀態(tài)，試劑流驅(qū)動力降低，部分樣品流向試劑通道．注樣時，將六通閥由注樣調(diào)回裝樣狀態(tài)，試劑溶液與樣品溶液維持層流流向各自廢液池完成樣品注射，見圖4[16]．這種方法的主要缺點是需要昂貴的泵閥系統(tǒng)，不利于普及．Huang等[17]在此基礎上作出改進，提出了一種重力驅(qū)動的無泵無閥芯片流動注射分析系統(tǒng).如圖5所示，芯片垂直放置，試劑由試劑池與試劑廢液池之間的液位差驅(qū)動，樣品則由樣品池與試劑廢液池之間的液位差驅(qū)動．本系統(tǒng)的流動注射分析操作分三步進行，第一步，控制廢液池高度使樣品和試劑流向各自的廢液池．第二步，增加樣品廢液池的高度使樣品池與樣品廢液池之間的液位差降低，部分樣品流向試劑通道．第三步，降低樣品廢液池的高度使其與第一步時高度相同，樣品和試劑重新流向各自廢液池，試劑與流入試劑通道的樣品混合.該系統(tǒng)用重力（液位差）作為試樣注射、試樣與試劑混合、傳輸和反應的驅(qū)動力，只需要控制樣品廢液池的移動就能實現(xiàn)芯片上簡單有效的門式進樣，采用芯片上液芯波導光度檢測系統(tǒng)及光電二極管實現(xiàn)高靈敏光度檢測.系統(tǒng)具有結(jié)構(gòu)簡單、易于操作、集成化程度高、加工價格便宜、利于普及等優(yōu)點.

圖4 使用泵閥改變流體壓力的流動注射

圖5 重力驅(qū)動無泵無閥芯片流動注射分析系統(tǒng)

1.4 基于集成微泵微閥的流動注射分析

隨著微加工技術的發(fā)展，在芯片上加工集成微泵微閥進行流動注射分析成為可能.2003年，Leach等[18]將蠕動泵、采樣閥、混合/反應通道、試樣選擇、流通檢測池等FIA系統(tǒng)的主要部件加工集成在一枚聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片上，見圖6[18]．流動注射的裝樣和注樣操作如圖7所示．采樣環(huán)由兩個入口和兩個出口組成并與流體通道相通，兩組閥共同控制閥的裝樣和注樣過程．裝樣時（7a，b）[18]，關閉一組閥，樣品流入采樣環(huán)，載流流入混合反應通道．注樣時（圖7c，d）[18]兩組閥的開閉狀態(tài)與裝樣時相反，載流將采樣環(huán)內(nèi)的樣品注射進入混合反應通道，本系統(tǒng)采樣體積僅為1.5 nL．該系統(tǒng)成功的用于堿性磷酸酯酶的分析．2009年，Jambovane等[19]在PDMS芯片上大規(guī)模集成微泵微閥進行多個平行的流動注射分析操作．該芯片上集成了樣品量取、混合/反應等多個功能，單次操作即可同時生成11種不同濃度的酶反應底物溶液，單次實驗即可快速測定酶反應動力學米氏常數(shù)和催

圖6 集成微泵微閥的芯片F(xiàn)IA系統(tǒng)

圖7 集成微泵微閥的芯片F(xiàn)IA系統(tǒng)的裝樣和注樣

采用芯片上集成微泵微閥進行流動注射分析的方法具有集成度高，可提高系統(tǒng)的微型化和集成化水平，但是芯片的結(jié)構(gòu)和操作皆較復雜，而且需要配置高精度和程序化的電路與氣路系統(tǒng).

1.5 基于取樣探針的芯片流動注射分析系統(tǒng)

Du等[20]提出了一種基于毛細管取樣探針和缺口型試樣管的重力驅(qū)動流動注射分析系統(tǒng)，毛細管與芯片耦合作為取樣探針，在試樣管和載液管上加工可供取樣探針進出的缺口，試樣管和載液管間隔排列在程序控制的自動平移臺上．如圖8[20]所示，進行流動注射分析操作時，探針保持水平位置不動，通過一維平移自動平移臺上的缺口管陣列，使探針依次經(jīng)缺口進入樣品管和載液管實現(xiàn)樣品和載液的切換．該系統(tǒng)流動注射分析操作分三步進行，首先將取樣探針停留在載液管內(nèi)使載流在重力作用下流入芯片通道．第二步，平移自動平移臺使取樣探針進入樣品管內(nèi)并停留一段時間，一定體積的樣品在重力作用下流入芯片通道．第三步，移動平移臺使取樣探針進入載液管引入載液完成一次流動注射操作.該系統(tǒng)的分析通量最高可達1 000樣/h，最低試樣消耗僅為0.6 nL/樣，分析精度達到0.6%(n=11)．2010年，Sun等[21]建立了一種基于一體化取樣探針和缺口管陣列的流動注射液滴分析系統(tǒng)，將樣品引入、試劑加入與液滴生成等多單元集成于一體化取樣探針內(nèi)（見圖9）[21]．該系統(tǒng)的集成度和自動化程度均較高，為液滴微流控系統(tǒng)提供了一種進行流動注射操作的模式．該系統(tǒng)成功應用于蛋白質(zhì)結(jié)晶沉淀劑的篩選與酶抑制分析．

圖8 基于毛細管取樣探針的FIA系統(tǒng)

圖9 基于一體化取樣探針的FIA液滴分析系統(tǒng)

1.6 液滴注射

近年來，液滴微流控受到了包括化學、生命科學與醫(yī)學等領域科學家的廣泛關注，流動注射模式對液滴的取樣操作具有借鑒意義．2008年，F(xiàn)idalgo等[22]提出了采用電融合的方法將流動的水相液滴注入連續(xù)的水相流體的方法．當注射區(qū)域的電極之間沒有施加電壓時，液滴流與連續(xù)流互不干擾，電極之間施加一定電壓時，注射區(qū)域的液滴與連續(xù)水相流體融合完成液滴的注射．進行液滴注射的另一種方法是將微通道進行選擇性修飾．Edgar等[23]和Roman等[24]將液滴生成與流動通道修飾為疏水性質(zhì)，而電泳分離通道保持親水性．樣品在疏水通道內(nèi)被油相間隔成液滴，隨后注射進入親水性的分離通道進行電泳分離，實現(xiàn)了液滴生成-液滴流動注射-電泳分離的一體化．Zhu等[25]則開發(fā)了一種“親水舌”的液滴取樣結(jié)構(gòu)，將水相液滴從油相注射進入質(zhì)譜載流中，調(diào)節(jié)廢液池液面高度可改變液滴的進樣體積.

2 結(jié)論

早在μTAS概念提出之前，流動注射分析的創(chuàng)始人Ruzicka與Hansen就開始致力于流動注射分析的微型化．1984年，Ruzicka與Hansen以FIA的思想為指導提出了集成化微管道系統(tǒng)（integrated microconduit systems，IMCS）的概念[26]，限于當時科學技術的發(fā)展水平，這一概念在當時并未能受到足夠的重視.隨著科學技術水平的持續(xù)進步和微加工技術的發(fā)展，流動注射分析面臨著又一次發(fā)展機遇，同時流動注射分析法對微流控芯片分析的微流體操作具有較大的借鑒意義.

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Microfluidic Chip-based Flow Injection Analysis

XU Chun-xiu

（Department of Chemistry,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China）

Flow injection analysis(FIA)revolutionized the traditional analytical chemistry which should be performed under physical and chemical equilibrium,FIA have advantages including wide applicability,high efficiency,low consumption,good reproducibility and automation over traditional analytical methods.Recently,the miniaturized total analysis system(or lab on a chip)evolved rapidly,providing opportunities for developing the theories and technologies of FIA.This paper reviews the various methods for performing FIA in microfluidic chips.

microfluidic chip；flow injection analysis；miniaturized total analysis system

O657 < class="emphasis_bold">文獻標識碼：A

A

1007-6883(2011)03-0050-06

2011-03-14

韓山師范學院青年科學基金資助（基金編號：413611，413615）

徐春秀（1978-），女，江西吉安人，韓山師范學院化學系講師.

責任編輯 爾 遲 楊培奎