蘇艷蓉 ，柴立元，楊志輝，尤翔宇，朱詠華

(1.中南大學 冶金科學與工程學院，長沙 410017；2.中機國際工程設(shè)計研究院有限責任公司，長沙 410007)

重金屬鉛具有不可降解和生物累積特性，因此，水體中的鉛對生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成了巨大威脅。目前，含鉛廢水的處理方法主要有沉淀、吸附、電解和膜分離[1]等。但這些方法普遍存在成本高、二次污染嚴重、對痕量重金屬處理效果差等缺點。生物吸附[2]因其成本低廉、材料來源廣泛等優(yōu)點逐漸成為研究熱點。

從受重金屬污染的土壤中分離篩選出的微生物，因受生存環(huán)境中重金屬的脅迫，既對重金屬有一定耐受性，又能對重金屬具有高效吸附能力，因此具有成為高效重金屬吸附劑的潛力。潘蓉等[3]研究了青霉菌對重金屬 Cd2+、Cu2+、Zn2+和 Pb2+的吸附特性，結(jié)果表明，菌絲體對重金屬的吸附能力表現(xiàn)出一定的差異性，對Pb2+的吸附率和吸附量明顯高于其他3 種金屬的。對 Cd2+、Cu2+和Zn2+的吸附率隨金屬濃度的升高而下降，吸附量隨金屬濃度的增加先增大后減??；當濃度增加到較高值時，Pb2+的吸附率開始下降，吸附量先逐漸增加后變化不大。RIORDAN和MCHALE[4]研究表明經(jīng)過清洗預處理不經(jīng)過清洗預處理的非活性酵母(干質(zhì)量)對Pb2+的最大吸附量分別達到127 mg/g和 99 mg/g。但是，目前國內(nèi)外學者在生物吸附方面開展的研究工作主要集中在真菌[5]、藻類[6]和酵母[7]等，而以細菌作為生物吸附劑材料的國內(nèi)外報道較少。細菌是近地表環(huán)境中分布最廣、生物量最大的生物類型。細菌細胞表面通常都有多種帶負電荷的功能基團，如羧基、磷?；土u基等[8]，因此，表現(xiàn)出顯著的親金屬特性[9]，且以細菌作為吸附劑具有效率高、選擇性強和吸附容量大等特點[10]。

本文作者以從重金屬污染土壤中分離、篩選出的一株對 Pb2+具有高耐受性的細菌 pannonibacter phragmitetus T1作為研究對象，在實驗室條件下對影響Pb2+吸附的主要因素以及吸附機理進行研究，揭示pannonibacter phragmitetus T1吸附 Pb2+的特性和規(guī)律，以期為生物吸附劑在工業(yè)化廢水處理中的應用提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 實驗材料

從重金屬污染土壤中分離得到一株重金屬耐受細菌，對其進行16srDNA序列分析，并結(jié)合其形態(tài)特征、培養(yǎng)條件、生理生化特征進行鑒定，按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第9版)，該菌被鑒定為Pannonibacter phragmitetus，命名為T1菌。

將保存的菌種接種到新鮮的LB固體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)48 h后進行活化，選取單克隆菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，獲得對數(shù)生長期菌液。再以體積分數(shù)為2%的接種量將菌液接入LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h后，經(jīng)5 000 r/min離心20 min收集菌體，并用去離子水洗滌3次，收集濕菌體作為活性菌體吸附劑，將濕菌體于80 ℃烘干恒定，作為非活性吸附劑備用。

LB液體培養(yǎng)基：將胰蛋白胨(Tryptone)10 g/L、酵母提取物(Yeast extract)5 g/L、氯化鈉(NaCl)5 g/L組成pH值為7.4～7.6的液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基在 0.105 MPa、121.3 ℃條件下高壓蒸汽滅菌25 min。LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂15～20 g/L。

Pb2+溶液的配制：稱取一定量的分析純Pb(NO3)2，溶解在去離子水中，定容后配制成 1 000 mg/L的含Pb2+溶液，再用去離子水將其稀釋制成不同濃度。

1.2 實驗方法

1.2.1 吸附條件實驗

實驗中分別研究了細菌代謝活動、細菌菌齡、溶液pH、菌體用量以及溫度對Pb2+吸附的影響，具體實驗過程如下。

細菌代謝活性對吸附的影響：在Pb2+離子初始濃度(ρi)為 50、100、150、200和 250 mg/L，pH 值為 6的溶液中，分別加入培養(yǎng)時間為12 h的活性菌體(干質(zhì)量)和滅活菌體(ρb)0.50 g/L，于30 ℃下振蕩 90 min，離心 20 min除去菌體，收集上清液，測定上清液中Pb2+離子濃度(ρf)。

細菌培養(yǎng)時間對吸附的影響：在 ρi為 150 mg/L的溶液中，分別加入培養(yǎng)時間為6、12、24、36、48、96 h及ρb為0.50 g/L的滅活菌體，然后于30 ℃、pH值為6的條件下振蕩吸附90 min，離心20 min除去菌體，收集上清液，測定上清液中Pb2+離子濃度(ρf)。

溶液pH值對吸附的影響：將ρi為150 mg/L的溶液，用0.5 mol/L HNO3或0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值分別至1、2、3、4、5和6，各加入培養(yǎng)時間為12 h、ρb為0.50 g/L的滅活菌體，然后于30 ℃振蕩吸附90 min，離心20 min除去菌體，測定上清液中Pb2+離子濃度(ρf)。

菌體用量對吸附的影響：在ρi為150 mg/L的溶液中，分別加入培養(yǎng)時間為12 h，ρb分別為0.50、2.5、5.0、7.5和10.0 g/L的滅活菌體，然后于30 ℃、pH值為6的條件下振蕩吸附90 min，離心20 min除去菌體，測定上清液中Pb2+離子濃度(ρf)。

溫度對吸附的影響：在ρi為150 mg/L、pH值為6的溶液中，各加入培養(yǎng)時間為12 h、ρb為0.50 g/L的滅活菌體，然后分別于10、20、30、40和50 ℃的溫度下振蕩吸附90 min，離心20 min除去菌體，收集上清液，測定上清液中Pb2+離子濃度(ρf)。

以上各實驗分別重復3次。按下列公式計算菌體對 Pb2+的去除率(η)和吸附量(q)：

式中：ρi為 Pb2+離子初始濃度，mg/L；ρf為 Pb2+離子平衡濃度，mg/L；V為溶液體積，L；M為吸附菌體的干質(zhì)量，g。

1.2.2 吸附動力學

在ρi為150 mg/L、pH值為6的溶液中，分別加入培養(yǎng)時間為12 h、ρb為0.5 g/L的滅活菌體，然后分別于 30 ℃振蕩吸附 1、3、5、10、15、20、30、40、60、90、120、180和240 min后離心分離，收集上清液測定剩余Pb2+離子濃度(ρf)，并繪制吸附量與時間的關(guān)系曲線。

1.2.3 吸附等溫模型

在ρi分別為20、50、100、150和200 mg/L，pH值為6的溶液中，各加入培養(yǎng)12 h、ρb為0.50 g/L的的滅活菌體，然后于30 ℃的條件下吸附90 min，離心收集上清液，測定吸附平衡時的離子濃度 ρe，以 q對 ρe作圖得到等溫吸附曲線，并將實驗數(shù)據(jù)分別按Langmuir和Freundlich等溫吸附模型進行擬合。

1.3 分析方法

溶液中的Pb2+濃度用WFX?120型原子吸收分光光度計(北京瑞利公司生產(chǎn))測定，溶液 pH值用PHS?3E型pH計(上海雷磁公司生產(chǎn))測定，菌體表面功能團用 NICOLETIS10型紅外光譜儀(美國 Thermo公司生產(chǎn))進行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 細菌代謝活性對T1菌吸附Pb2+效果的影響

用活性菌體和滅活菌體作吸附材料進行試驗，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在50～250 mg/L的濃度范圍內(nèi)，具有代謝活性的菌體和滅活菌體對Pb2+都有一定的吸附量，且具有代謝活性的細胞對Pb2+的吸附量都大于滅活菌體的，但隨著濃度的升高，差距明顯減小。這是因為活性生物吸附過程可以分成2個階段[11]，第一階段發(fā)生在細胞壁表面，以吸附和離子交換過程為主，為快速過程；第二階段為主動吸收，即吸附在細胞表面的金屬離子進一步轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)部，反應進行緩慢。高濃度的重金屬會強烈抑制生物活性，影響第二階段反應的進行，使得生物富集在實際應用中受到很大限制。非活性細胞的吸附相當于活性生物吸附過程第一階段，只有表面吸附[12]，是一個不依賴細胞代謝和能量的過程，有利地解決了由于高濃度重金屬離子對活生物的毒性作用。一些學者研究發(fā)現(xiàn)，非活性菌體能以相等甚至更高的效率吸附重金屬[13]，且非活性菌體比活性菌體更易保存，從而解決了由于高濃度重金屬離子對活生物毒性作用而使其應用受到限制的問題。因此，以下均采用滅活菌體進行實驗。

圖1 菌體代謝活性對T1吸附Pb2+的影響Fig.1 Effect of metabolic activity of bacteria on biosorption of Pb2+ by T1

2.2 細菌培養(yǎng)時間對Pb2+吸附效果的影響

圖2所示為培養(yǎng)時間對T1菌吸附Pb2+的影響。由圖2可以看出，不同生長階段的滅活菌體對Pb2+的吸附能力有明顯的差異。對數(shù)期內(nèi)(6～24 h)Pb2+的吸附量均達到59.58 mg/g以上，培養(yǎng)時間為6 h(對數(shù)期前期)的菌體對 Pb2+的吸附能力最強，吸附量(82.32 mg/g)和去除率(31.26%)均為最高。進入穩(wěn)定期(24～72 h)后，Pb2+吸附量先下降后趨于穩(wěn)定，保持在 47 mg/g左右。衰退期(72 h以后)菌體對Pb2+吸附逐漸下降。這可能是由于與重金屬吸附密切相關(guān)的菌體細胞壁膜的主要成分(脂多糖、蛋白質(zhì)和磷脂、肽聚糖)和含量在生長過程中不斷發(fā)生變化。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，細胞壁膜的重金屬吸附能力隨培養(yǎng)時間變化，原因是壁膜中的外膜、內(nèi)膜與PEG層的含量以及外膜和內(nèi)膜對重金屬的吸附能力隨培養(yǎng)時間的變化而變化。細胞外膜的主要成分磷脂和脂多糖的含量以及內(nèi)膜的主要成分磷脂的含量隨菌齡的變化是導致不同生長時期細胞外膜和內(nèi)膜的重金屬吸附能力有顯著差異的主要原因。

圖2 培養(yǎng)時間對T1吸附Pb2+的影響Fig.2 Effect of culture time on biosorption of Pb2+ by T1

2.3 溶液pH值對T1菌吸附Pb2+效果的影響

圖3所示為pH值對T1菌吸附Pb2+的影響。由圖3可知，pH值對Pb2+吸附有較大的影響，隨著pH值的升高，吸附量和去除率逐漸增大。在 pH值等于 6時，吸附量和去除率分別為64.44 mg/g和24.64%。這可能是由于細菌細胞壁帶有負電荷，金屬離子與細胞表面結(jié)構(gòu)材料上的羧基陰離子和磷酸陰離子發(fā)生相互作用而被固定[15]。pH值較低時，細胞壁的吸附活性位點會被水合氫離子H3O+占據(jù)，使吸附劑質(zhì)子化，增加細胞表面的靜電斥力，而阻礙金屬離子對細胞壁的靠近，pH值越低阻力越大。當溶液pH值升高至超過細菌表面的等電點時，細胞表面負電荷量增加，可以充分吸附帶正電的金屬離子，有利于金屬離子的接近并吸附在細胞表面上。當pH值大于6時，溶液中出現(xiàn)微沉淀，Pb2+的狀態(tài)發(fā)生了改變。

圖3 pH值對T1吸附Pb2+的影響Fig.3 Effect of pH value on biosorption of Pb2+ by T1

2.4 菌體用量對Pb2+吸附效果的影響

將不同數(shù)量 T1菌體加入含 Pb2+的溶液中，研究菌體對Pb2+吸附性能，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著菌體用量的增加，Pb2+去除率迅速增加，但菌體對Pb2+的單位吸附量越來越小。在菌體用量為 7.50 g/L時，Pb2+去除率增加到93.29%。這可能是由于隨著菌量的增加，吸附位點也增加，使得吸附率升高，但是吸附率并不隨菌體加入量的增加而成比例增多，這說明在金屬離子濃度一定的吸附體系中，降低菌體濃度(提高金屬與菌體的濃度比)，只要菌體未被金屬飽和，菌體的吸附量便增加。但當菌體用量增加到一定程度時，Pb2+去除率增加幅度緩慢[16]。

圖4 菌體用量對T1吸附Pb2+的影響Fig.4 Effect of biomass concentration on biosorption of Pb2+by T1

2.5 溫度對T1菌吸附Pb2+效果的影響

圖5所示為溫度對T1菌吸附Pb2+的影響。由圖5可知，溫度明顯影響T1菌體對Pb2+的吸附效果。T1菌體對 Pb2+的吸附量和吸附效率都隨溫度升高而升高，在30 ℃時，T1菌體對Pb2+吸附量(62.01 mg/L)和去除率(21.81%)均最大。當溫度大于30 ℃時，T1菌體對 Pb2+的吸附量和吸附效率隨著溫度的升高而下降。這與啤酒酵母對Hg2+的吸附一致[17]。溫度在一定范圍內(nèi)升高，有利于菌體的吸附，而當溫度高于30 ℃時，溫度過高可能對細胞壁的結(jié)構(gòu)或化學物質(zhì)產(chǎn)生影響，也有可能是影響了與吸附位點有關(guān)的金 屬?菌體之間絡(luò)合的穩(wěn)定性，導致吸附量下降。

圖5 溫度對T1吸附Pb2+的影響Fig.5 Effect of temperature on biosorption of Pb2+ by T1

2.6 T1菌對Pb2+的吸附動力學2+

圖6所示為T1菌對Pb的吸附隨時間的變化。由圖6可知，T1菌對重金屬Pb2+的吸附大致可分為如下3個過程：前5 min，T1對Pb2+的生物吸附非常迅速，吸附量由0增加到64.84 mg/g，達到最大吸附量的90%以上[18]。6～40 min這段時間內(nèi)，T1對Pb2+的生物吸附比較緩慢，其吸附量只占整個吸附過程所吸附Pb2+的很小一部分，當吸附時間大于40 min時，吸附量略微下降，之后基本保持穩(wěn)定，說明細胞上被吸附的離子與溶液中的重金屬離子已達平衡。CHEN等[19]在研究滅活的 Pseudomonas putida CZ1菌體對Cu2+吸附時亦發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。由圖6還可知，整個吸附過程以較快的速度進行。說明T1對Pb2+的吸附在短時間內(nèi)即可完成，推測出該吸附過程主要是菌體細胞表面的吸附作用，這種作用的特點是快速、可逆、不依賴能量代謝，細胞壁對吸附起主要作用。

吸附動力學模型是表征吸附過程一種重要手段，其在吸附劑的實際應用中可以用來預測不同吸附時間下可以達到的吸附效率，其中在生物吸附方面使用較多的吸附動力學模型是 Pseudo學模型。陳燦等[20]研究表明，很多二價金屬離子的吸附動力學行為可以用準二級動力學方程描述。

Pseudo-second order模型是由HO等[21]提出來的，其方程如下：

式中：qt、qe分別為t時刻及平衡吸附量(mg/g)；k2為準二級速率常數(shù)(g/(mg·min?1))。

采用 Pseudo-second order模型對 T1菌體吸附Pb2+的實驗數(shù)據(jù)進行擬合，得到t/qt和時間t的線性擬合曲線，并且通過計算得到qe=68.35 mg/g，K2=0.029 g/(mg·min?1)，相關(guān)系數(shù) R2=0.999。因此，可以得出，該吸附過程可以用Pseudo-second order模型很好地描述和預測。

圖6 T1菌對Pb2+的吸附隨時間的變化Fig.6 Changes of Pb2+ biosorption by T1 vs.time

2.7 T1菌對Pb2+的等溫吸附模型

T1菌對Pb2+的等溫吸附曲線如圖7所示。由圖7可知，隨著 Pb2+初始質(zhì)量濃度的增加，Pb2+的吸附率降低，而平衡吸附量增大。當Pb2+質(zhì)量濃度較低時，Pb2+的濃度低于細胞表面的吸附位點，被吸附的百分比相對較大，反之則較??；由于菌的量一定，單位菌體的吸附量一定，隨著Pb2+質(zhì)量濃度的增加，同體積溶液中有效 Pb2+的量增加，Pb2+與菌體表面吸附位點的碰撞幾率必然上升，從而增加了菌體對Pb2+的吸附量。但是，這種增加不是無止境的，隨著Pb2+初始質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，吸附量的增加幅度越來越小。在實驗條件下Pb2+的最大吸附量可達67.97 mg/g。

Langmuir吸附模型假定吸附是單分子層的，體相溶液和吸附層均可視為理想溶液，即吸附質(zhì)分子之間不存在任何形式的相互作用。Freundlich吸附模型描述的是非均質(zhì)固體表面的吸附行為。

Langmuir方程和Freundlich方程分別如下：

式中：eρ為平衡濃度，mg/L；qe為平衡吸附量，mg/g；Q為最大吸附量；b為Langmuir常數(shù)，與吸附能量有關(guān)，表征吸附劑與吸附質(zhì)的親和力；k是表征吸附能力的常數(shù)；n為待定系數(shù)。

將實驗所得數(shù)據(jù)分別按Langmuir和Freundlich吸附等溫線方程進行回歸分析，擬合結(jié)果如表1所列。

圖7 T1菌對Pb2+的吸附等溫線Fig.7 Adsorption isotherm of Pb2+ by T1

表1 Pb2+等溫吸附模型擬合參數(shù)Table 1 Parameters of Pb2+ by different isotherm adsorption models

以上結(jié)果可以看出，Langmuir和Freundlich吸附等溫方程的相關(guān)系數(shù)都達到了0.99以上，都能在一定程度上描述 T1對 Pb2+的吸附。類似的現(xiàn)象在Steptomyces coelicolor A3(2)細菌吸附 Cu2+和 Ni2+[22]以及Aeromonas caviae細菌吸附Cd2+的實驗[23]中也有發(fā)現(xiàn)。Langmuir能夠更好地描述該吸附過程，說明溶液中Pb2+在吸附劑表面是單分子層的表面吸附。

2.8 紅外光譜吸收分析(FTIR)

由圖8可以看出，在3 800～3 000 cm?1處有一較寬的吸收帶，最大吸收峰將在3 443.24 cm?1處，來自O(shè)—H的伸縮振動，是O—H，N—H鍵伸縮振動吸收，來自多糖、脂肪酸和蛋白質(zhì)等組分的貢獻。2 962.94 cm?1和2 928.34 cm?1處的譜峰分別來自蛋白質(zhì)和脂類的—CH2和—CH3，是典型的脂碳鏈(—CH3、=CH2、=CH—)的 C—H鍵的伸縮振動吸收帶，它反映脂肪酸、各種膜和細胞壁組分的親水脂分子的信息。1 642.79 cm?1處的譜峰來自仲酰胺Ⅰ帶，是—C=O的伸縮振動引起的。1 546.48 cm?1處的譜峰來自仲酰胺Ⅱ帶，是N帶譜的彎曲振動和C彎曲的伸縮振動特征譜帶，這兩個峰是蛋白質(zhì)的特征譜帶。1 401.06 cm?1處的譜峰來自酰胺Ⅲ帶，是C譜的伸縮振動和N伸縮的彎曲振動引起的[24]。1 453.49 cm?1處的譜峰來自—CH3和—CH2—的彎曲振動。1 241.08處的譜峰是糖環(huán)上—C—O—C—收縮的糖類特征峰，表明菌細胞壁含有大量多糖及蛋白質(zhì)等物質(zhì)。胺基中C—N的伸縮振動、磷酸脂和糖環(huán)的振動出現(xiàn)在1 112.15和1 078.86 cm?1處。972.48 cm?1處的峰可歸屬于磷酸化蛋白和核酸中磷酸單酯二價陰離子—PO42?基團的對稱伸縮振動。974.77 cm?1為多糖骨架振動吸收帶，主要是糖類的C—OH的伸縮振動，可能也含P—O—C伸縮振動的貢獻。低于600 cm?1的525.25 cm?1處的譜峰是M的譜(M是金屬離子)和O的振動吸收峰[25]。由此可以初步推斷，pannonibacter phragmitetus T1細菌主要含有羥基、胺基、酰胺基、羧基和磷酸脂。

圖8 T1吸附Pb2+前后的紅外光譜Fig.8 FTIR spectra of T1 before(a)and after(b)adsorbing Pb2+

菌體吸附Pb2+后羥基峰紅移至3 420.95 cm?1，且與—M—O(O—M—O)吸收峰一樣增強并增寬。吸附后1 642.79、1 546.48和1 401.06 cm?1處的吸收峰峰形變窄，吸光度變大。結(jié)果表明：羥基和酰胺基是吸附、絡(luò)合或螯合金屬離子或原子的主要活性基團。吸附后沒有新的譜帶出現(xiàn)，表明Pb2+并未破壞吸附劑本身的結(jié)構(gòu)，進一步證明菌體對Pb2+是表面吸附過程。

3 結(jié)論

1)Pannonibacter phragmitetus T1菌對Pb2+具有良好的吸附性能，菌體的代謝活性、菌體的生長階段、pH值、菌體用量、溫度、Pb2+離子濃度明顯影響Pb2+的吸附。

2)Pannonibacter phragmitetus T1菌對Pb2+吸附的最佳條件是滅活 T1菌、菌齡 12 h、Pb2+濃度為 150 mg/L、pH值為6、菌體加入量為0.5 g/L、溫度為30 ℃，最佳條件下T1菌體對Pb2+的吸附量為68.35 mg/g。

3)Pannonibacter phragmitetus T1菌對Pb2+的吸附速度較快，Pb2+的吸附符合Pseudo-second order動力學模型和Langmuir、Freundlich等溫吸附模型。菌體可能主要是借助細胞表面成分的羥基、酰胺基等活性基團與Pb2+絡(luò)合，進而吸附Pb2+。

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