李世琴，安文汀，李榮霞，趙俊紅，焦勇

（山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，太原 030006）

1 引言

生物成像是一個(gè)多學(xué)科交融、多技術(shù)集成、發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的新興領(lǐng)域。以核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)和計(jì)算機(jī)體層攝影(Computed Tomography,CT)為代表，生物醫(yī)學(xué)成像在臨床診斷上發(fā)揮著不可替代的重要作用［1］。

生物熒光成像是近年來(lái)發(fā)展較快、引人矚目的生物成像方向之一。熒光技術(shù)因其快捷、靈敏、重復(fù)性好、無(wú)放射性，多個(gè)光物理參量（如激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)、熒光強(qiáng)度、熒光壽命、發(fā)射各向異性）可用于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在生命科學(xué)研究中獲得了廣泛應(yīng)用［2-3］。熒光探針是生物熒光成像的核心技術(shù)之一。目前為止，熒光探針可大體上分為：（1）化學(xué)類：有機(jī)染料，納米材料（含半導(dǎo)體量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換稀土納米粒子、貴金屬粒子、納米鉆石等），以及金屬配合物（含稀土配合物）等；（2）生物類：藻膽蛋白，基因編碼熒光蛋白 （如Green Fluorescent Protein,GFP）， 分子燈標(biāo)（Molecular Beacon，一類發(fā)卡結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸熒光探針）等。本文僅對(duì)目前應(yīng)用最為廣泛的有機(jī)染料和研究最為活躍的半導(dǎo)體量子點(diǎn)及上轉(zhuǎn)換稀土納米粒子等化學(xué)類熒光探針，從發(fā)光機(jī)制、設(shè)計(jì)發(fā)展策略、合成制備方法以及生物成像應(yīng)用實(shí)例等方面，予以簡(jiǎn)要評(píng)述。

2 生物成像用熒光探針的一般屬性

一般地，適用于生物成像的熒光探針須具備以下性質(zhì)：

（1）光物理性質(zhì)：便于激發(fā)和檢測(cè)，不會(huì)與生物基質(zhì)同時(shí)被激發(fā)，生物背景干擾小；較高的摩爾消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率；

（2）化學(xué)性質(zhì)：在相關(guān)緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)液或體液中較好的溶解性；使用條件下的熱、光穩(wěn)定性；標(biāo)記的位點(diǎn)特異性；

（3）生物相容性：標(biāo)記所帶來(lái)的立體或尺寸相關(guān)的干擾效應(yīng)要盡量??；易于進(jìn)入細(xì)胞；標(biāo)記的生物毒性小。

3 有機(jī)染料

有機(jī)染料是目前應(yīng)用最為廣泛的一類熒光探針。有機(jī)染料的光物理性質(zhì)取決于其分子的電子躍遷類型：（1）離域于整個(gè)發(fā)色團(tuán)的共振躍遷，相應(yīng)的染料稱為共振染料；（2）分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移躍遷，相應(yīng)的染料稱為電荷轉(zhuǎn)移染料。依據(jù)結(jié)構(gòu)－性質(zhì)關(guān)系，可以通過(guò)精心的設(shè)計(jì)策略實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)光性質(zhì)的精細(xì)調(diào)控。大多數(shù)常見熒光探針，諸如熒光素類、羅丹明類、大多數(shù)的氟 硼熒類 （Boron-dipyrromethene,BODIPY）和花菁素類，都屬于共振染料。其特征是：相對(duì)較窄的、通?；殓R像的吸收和發(fā)射帶；溶劑極性不敏感的、較小的Stokes位移；高的摩爾消光系數(shù)；中等或高的熒光量子產(chǎn)率。然而，吸收和發(fā)射光譜的有限的分離，使得不同染料之間的相互干擾不易避免。相反地，電荷轉(zhuǎn)移染料，例如香豆素類，在極性溶劑中則具有分離較好的、較寬的吸收和發(fā)射帶，較大的依賴于溶劑極性的Stokes位移。然而，摩爾消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率通常較共振染料為之低。

有機(jī)染料類熒光探針的設(shè)計(jì)發(fā)展策略多種多樣。其中一種常見的設(shè)計(jì)發(fā)展策略就是基于某一類母體結(jié)構(gòu)而不斷修飾、功能化的衍生策略。以羅丹明類染料為例，就是以氧雜蒽為母體結(jié)構(gòu)而發(fā)展起來(lái)的一類堿性染料。早在三十年前，具有強(qiáng)紅色熒光的磺化羅丹明B和磺化羅丹明101衍生物就與熒光素連接在一起，被用于雙信號(hào)或多信號(hào)的熒光分析檢測(cè)［4-5］。此后，Lefevre等［6］利用6-氨基己酸將磺化羅丹明B和磺化羅丹明101衍生物連接起來(lái)，提高了熒光特性，使之更適于熒光標(biāo)記。Nagano等［7］開發(fā)了一種基于羅丹明發(fā)色團(tuán)的NO熒光探針，550nm激發(fā)，檢測(cè)限7nm，已成功用于活細(xì)胞的NO熒光成像。近來(lái)，復(fù)旦大學(xué)李富友等［8］發(fā)展了一種羅丹明類熒光染料，利用Cu2+與氧、硫原子的配位作用而引起羅丹明結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)Cu2+的胞內(nèi)外檢測(cè)。

另一種設(shè)計(jì)發(fā)展策略可稱為靶標(biāo)導(dǎo)向策略。例如，活性氧物種（Reactive Oxygen Species,ROS）熒光探針是近年來(lái)有機(jī)熒光探針的研究熱點(diǎn)之一。ROS與生命體的健康、老化和疾病都有密切關(guān)系。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧氣的主要消耗者，是ROS的主要源頭，在ROS的生物學(xué)研究中居于中心地位。線粒體靶向的ROS熒光探針為揭示ROS的生化奧秘可提供高時(shí)空分辨率的強(qiáng)有力工具。線粒體靶向的ROS熒光探針的設(shè)計(jì)策略是：從功能要求出發(fā)，結(jié)構(gòu)上由兩部分組成：（i）靶向載體部分，定向輸運(yùn)分子到線粒體；（ii）高選擇性、特異性的分子開關(guān)部分，與特定ROS作用后，點(diǎn)亮熒光。例如，Chang等［9］報(bào)道了一例這類探針MitoPY1。它以親脂性陽(yáng)離子三苯基膦（Triphenylphosphonium,TPP）基團(tuán)為靶向線粒體的分子載體。靶向機(jī)理是，由跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子梯度所形成的負(fù)電勢(shì)，可以使陽(yáng)離子基團(tuán)通過(guò)靜電作用定位于線粒體。分子開關(guān)部分機(jī)理是由硼酸基團(tuán)選擇性地與H2O2反應(yīng)，打開羅丹明的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，從而形成大共軛體系而產(chǎn)生熒光。Guo等［10］報(bào)道了一種H2O2和氧還金屬離子 “串連雙開關(guān)模式”的熒光探針，即只有在一定濃度的H2O2存在的前提下 （開關(guān)1），同時(shí)存在氧還金屬離子（開關(guān)2），熒光探針才會(huì)被 “點(diǎn)亮”。這種熒光探針在細(xì)胞的氧化脅迫狀態(tài)（H2O2水平）的實(shí)時(shí)檢測(cè)，以及活體組織的抗Fenton反應(yīng)方面有較大應(yīng)用潛力。

利用有機(jī)染料標(biāo)記蛋白質(zhì)等生物大分子，進(jìn)而利用多種熒光成像手段研究被標(biāo)記物種的跨膜行為，胞內(nèi)分布，與特定細(xì)胞器的共定位，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，以及生理及病理效應(yīng)等活細(xì)胞熒光成像分析，在分子生物學(xué)、生理學(xué)和病理學(xué)研究領(lǐng)域越來(lái)越成為一種直觀有效的研究模式。

簡(jiǎn)言之，有機(jī)染料分子小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、可以快速通過(guò)很多生物屏障，且商品化的分子較多，在體內(nèi)外熒光成像、DNA自動(dòng)測(cè)序、抗體免疫分析、抗癌藥物開發(fā)、疾病診斷等方面應(yīng)用廣泛。但一般而言，其光化學(xué)穩(wěn)定性較差，易于光漂白和降解；Stocks位移較小，易于受到干擾而降低檢測(cè)靈敏度；熒光壽命在細(xì)胞和組織內(nèi)停留時(shí)間較短，較難以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)信號(hào)追蹤，使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到了一定限制。

4 半導(dǎo)體量子點(diǎn)

半導(dǎo)體量子點(diǎn)（Quantum Dots,QDs）是一類由Ⅱ-Ⅵ或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的、粒徑小于或接近激子波爾半徑的納米粒子。其光物理性質(zhì)表現(xiàn)出顯著的量子限域效應(yīng)（Quantum Size Effect,QSE），即熒光的吸收和發(fā)射性質(zhì)依賴于粒徑大小，隨著粒徑減小而藍(lán)移。半導(dǎo)體量子點(diǎn)具有以下獨(dú)特的光譜性質(zhì)：（1）“寬激發(fā)，窄發(fā)射”，即激發(fā)波長(zhǎng)范圍寬而發(fā)射波長(zhǎng)范圍窄，因而可用同一波長(zhǎng)同時(shí)激發(fā)多種量子點(diǎn)而獲得多色熒光；（2）發(fā)射峰較窄，峰形對(duì)稱，重疊?。唬?）量子限域效應(yīng)顯著，可以通過(guò)調(diào)節(jié)粒徑和組成來(lái)實(shí)現(xiàn)發(fā)射波長(zhǎng)的調(diào)控；（4）熒光強(qiáng)度較高、穩(wěn)定性及抗光漂白能力較強(qiáng)，便于對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行長(zhǎng)期、實(shí)時(shí)跟蹤觀察；（5）經(jīng)表面修飾后，生物兼容性好，易于進(jìn)行特異性連接，進(jìn)而進(jìn)行生物活體標(biāo)記和檢測(cè)；（6）雙光子截面較大，可在較低激發(fā)強(qiáng)度下進(jìn)行活體的深層組織成像?；谏鲜鎏攸c(diǎn)，近年來(lái)量子點(diǎn)在生物分子檢測(cè)、細(xì)胞和活體多色標(biāo)記成像、正常及病變組織的定位和成像等領(lǐng)域的應(yīng)用得到了快速發(fā)展。

量子點(diǎn)有多種合成方法，包括溶膠凝膠法、氣相沉積法、電化學(xué)沉積法和微乳液法等。早期由氣相沉積法制得的量子點(diǎn)粒徑分布寬，量子產(chǎn)率低。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，溶膠法制備的量子點(diǎn)具有很好的發(fā)光性能，成為目前應(yīng)用最廣泛的制備方法。溶膠法分為有機(jī)相法和水相法兩種。盡管有機(jī)相法制備的量子點(diǎn)具有結(jié)晶性好、尺寸均一、粒度可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，但該方法條件苛刻，原料昂貴，毒性大，易燃易爆，且制得的量子點(diǎn)在空氣中不穩(wěn)定性，特別是納米晶表面通常包覆著憎水性基團(tuán)，限制了其在生物成像的應(yīng)用。比較而言，水相法有很多優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)單、毒性小、成本低，最突出的就是可以根據(jù)需要直接設(shè)計(jì)成生物探針，無(wú)需進(jìn)一步修飾。近年來(lái)發(fā)展的高溫水熱法和微波輔助水熱法等進(jìn)一步提高了量子點(diǎn)的相關(guān)性能。我們實(shí)驗(yàn)室主要采用水熱法合成水溶性CdTe/CdS殼核量子點(diǎn)，并將其應(yīng)用于活細(xì)胞熒光成像。

量子點(diǎn)進(jìn)一步與抗體或靶向性的小分子配體相偶聯(lián)，可用于細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特異性標(biāo)記。1998年，Alivisatos等［11］報(bào)道了量子點(diǎn)的生物標(biāo)記，初步解決了量子點(diǎn)的水溶性及與生物分子偶聯(lián)問(wèn)題。Zhao等［12］利用細(xì)胞核特異性染料Hoechst 33342的“分子向?qū)А弊饔?，將其與水溶性CdTe量子點(diǎn)以非共價(jià)形式偶聯(lián)起來(lái)，成功地將量子點(diǎn)定位于活細(xì)胞的核酸負(fù)電骨架上。龐代文等［13］開展了基于量子點(diǎn)的熒光免疫技術(shù)研究，同時(shí)對(duì)乳腺癌的HER2和ER細(xì)胞進(jìn)行了雙色熒光成像。張春陽(yáng)等［14］利用雙光子掃描熒光顯微鏡，觀察、驗(yàn)證了量子點(diǎn)標(biāo)記的天花粉蛋白以受體介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進(jìn)入人絨癌細(xì)胞的機(jī)理，及其在細(xì)胞內(nèi)的分布。此外，用量子點(diǎn)標(biāo)記前列腺特異性膜抗原（PSMA）的抗體，經(jīng)小鼠尾靜脈注射，實(shí)現(xiàn)了對(duì)表達(dá)PSMA的前列腺癌的靶向成像［15］；量子點(diǎn)偶聯(lián)曲妥單抗，被成功地用于KPL-4荷瘤裸鼠中Her2的成像研究，在活體中觀察到量子點(diǎn)從血管逐步移入細(xì)胞核的整個(gè)過(guò)程［16］。

盡管QDs的應(yīng)用研究非常廣泛，但目前仍面臨諸多挑戰(zhàn)：粒徑均一化控制較難，表面缺陷較多，影響發(fā)光穩(wěn)定性；生物標(biāo)記時(shí)多個(gè)生物分子會(huì)同時(shí)連接在量子點(diǎn)上，難于控制生物分子的取向、可能發(fā)生團(tuán)聚；生物毒性問(wèn)題等。另外，熒光的非單指數(shù)型衰減行為，使之不適用于時(shí)間分辨的熒光檢測(cè)。

有機(jī)染料和量子點(diǎn)的發(fā)光機(jī)制是光子能量損失的下轉(zhuǎn)換過(guò)程，即發(fā)射波長(zhǎng)較激發(fā)波長(zhǎng)為之長(zhǎng) （紅移）。當(dāng)用紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，其在生物成像上所面臨的突出問(wèn)題就是生物組織自體熒光產(chǎn)生的背景干擾。稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子（Upconversion Rare Earth Nanoparticles,UCRE-NPs）有望克服這一難題。其發(fā)光機(jī)制是稀土納米粒子吸收兩個(gè)或多個(gè)低能光子而輻射一個(gè)高能光子的上轉(zhuǎn)換過(guò)程，即發(fā)射波長(zhǎng)比激發(fā)波長(zhǎng)短的反Stokes發(fā)光。利用稀土上轉(zhuǎn)換納晶的這一獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，以近紅外或紅外光為激發(fā)源，熒光成像時(shí)可大大降低或消除自體熒光干擾、提高信噪比和檢測(cè)靈敏度。同時(shí)，近紅外光還具有對(duì)生物組織幾乎無(wú)損傷的、高達(dá)十?dāng)?shù)厘米的穿透力。因而，近年來(lái)近紅外光激發(fā)－可見光發(fā)射的稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子激起了人們?cè)絹?lái)越濃厚的研究興趣。

稀土上轉(zhuǎn)換納米材料的制備方法主要有熱分解法、水熱溶劑熱法、共沉淀法和溶膠凝膠法等。稀土氟化物是目前多種稀土上轉(zhuǎn)換納米材料中發(fā)光效率較高、應(yīng)用較多的一種。熱分解法的典型步驟是，將預(yù)先制備好的三氟乙酸稀土鹽添加到高沸點(diǎn)有機(jī)溶劑（油酸、油胺等）中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下升溫至250-340℃，使三氟乙酸稀土鹽熱分解生成稀土氟化物納米晶體。北京大學(xué)嚴(yán)純?nèi)A等［17］利用熱分解方法制備了單分散的LaF3三角納米盤，隨后通過(guò)改變溫度、加熱時(shí)間等條件，制備了各種形貌可控的不同晶相的稀土熒光納晶。稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子的粒徑一般較大，通常在十幾、幾十或上百納米。為了使標(biāo)記物更小、更穩(wěn)定，近來(lái)Chen等［18］由熱分解法制備了粒徑7－10nm的上轉(zhuǎn)化NaYF4:Yb3+/Tm3+/Ho3+納晶，近紅外激發(fā)和發(fā)射，被稱為“生命組織的透明觀察窗”。清華大學(xué)李亞棟等［19］利用水熱合成法合成了形貌各異、粒徑可調(diào)的單分散納米晶體。

在制備得到結(jié)晶度好、摻雜均勻、粒徑均一、單分散性的稀土納晶后，為了適用于生物成像，需要進(jìn)一步通過(guò)表面改性（如二氧化硅/聚合物包覆、配體交換/氧化）和靶向性修飾，使納晶具有良好的水溶性以及一定的靶向選擇性。Wang等［20］報(bào)道了利用固液兩相溶劑熱法合成NaYbF4上轉(zhuǎn)換納米粒子，通過(guò)調(diào)節(jié)摻雜稀土離子種類或濃度，實(shí)現(xiàn)了在單一近紅外波長(zhǎng)980nm激發(fā)，可發(fā)射橙、黃、綠、青、藍(lán)等多色熒光上的轉(zhuǎn)換納米粒子。通過(guò)包覆硅殼層改善水溶性，并聯(lián)接兔抗－CEA8抗體，實(shí)現(xiàn)了活HeLa細(xì)胞的免疫標(biāo)記和熒光成像。

作為新一代熒光探針，稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料除了具備前述的內(nèi)稟優(yōu)勢(shì)外，還有吸收和發(fā)射帶窄，Stokes位移大，光、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可以預(yù)見其在生物成像方面必將發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

5 結(jié)論與展望

基于有機(jī)染料的生物成像仍然是目前發(fā)展最為成熟的、實(shí)用化熒光成像技術(shù)。有機(jī)染料為人們提供了一種簡(jiǎn)捷、安全、相對(duì)價(jià)廉、使用標(biāo)準(zhǔn)化的熒光探針。盡管其光譜特性不是最優(yōu)的，光化學(xué)穩(wěn)定性也不是最高的，但有機(jī)染料以其變化無(wú)窮的完全共價(jià)構(gòu)筑的小分子特性，繼續(xù)拓展著自身的發(fā)展空間。

以量子點(diǎn)和上轉(zhuǎn)換稀土納米粒子為代表的熒光納米粒子，具有誘人的應(yīng)用前景。量子點(diǎn)和上轉(zhuǎn)換稀土納米粒子的突出優(yōu)點(diǎn)就是可以實(shí)現(xiàn)單波長(zhǎng)激發(fā)下的多色編碼，同時(shí)檢測(cè)，從而極大地簡(jiǎn)化了多色成像。盡管熒光納米粒子具有獨(dú)特、優(yōu)異的光譜性質(zhì)和穩(wěn)定性，但要在生物成像上真正實(shí)用化，還要進(jìn)一步發(fā)展表面修飾技術(shù)，提高水溶性、表面包覆的穩(wěn)定性、生物相容性和靶向性，并降低生物毒性。隨著研究的深入，新興的納米熒光探針在生物成像上將會(huì)發(fā)揮更大的作用。

毋庸置疑，生物成像用熒光探針是一個(gè)生機(jī)勃勃、充滿挑戰(zhàn)的領(lǐng)域。面對(duì)生命系統(tǒng)的復(fù)雜性，不存在通用的熒光探針工具。只有盡可能地研究開發(fā)更多種類的熒光探針才有可能滿足多方面的需求。不難預(yù)測(cè)，各類熒光探針的未來(lái)格局是，性能互補(bǔ)，共同發(fā)展，為生物成像提供更大的可選擇空間。

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