曹本文, 王衛(wèi)國, 李戰(zhàn)雄, 徐紅巖

(1. 蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院,江蘇 蘇州 215021;2. 中國科學(xué)院 上海有機(jī)化學(xué)研究所,上海 200032)

新藥齊考諾肽(1)能治療與創(chuàng)傷、腫瘤和神經(jīng)痛等相關(guān)的慢性疼痛及對阿片類藥物不敏感的難治性疼痛[1]。1為環(huán)形肽，含有三對二硫鍵,其25個(gè)氨基酸序列為:Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys，其肽鏈結(jié)構(gòu)中二硫鍵的連接模式為Cys1-Cys16, Cys8-Cys20, Cys15-Cys25[2]。

作為一種含有二硫鍵的多肽，分子結(jié)構(gòu)中二硫鍵的準(zhǔn)確形成是合成1的關(guān)鍵技術(shù)[3]。通過巰基氧化形成多肽分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵時(shí)，僅僅含一對二硫鍵時(shí)比較容易選擇反應(yīng)條件，如通過空氣,I2, H2O2,汞鹽等氧化[4]。但是，1氧化形成三對二硫鍵的情況比較復(fù)雜，反應(yīng)會(huì)形成多種異構(gòu)體，因此需選擇合適的氧化方法—─即選擇性氧化[5]。

本文利用不同巰基保護(hù)基的氧化反應(yīng)性差異，分別以空氣和碘作氧化劑，通過選擇性氧化使齊考諾肽線性肽(2)的1,8,16,20-位兩對Trt保護(hù)巰基先形成兩對二硫鍵，制得含兩對二硫鍵的齊考諾肽(3);3經(jīng)碘氧化15,25-位Acm保護(hù)的巰基，成功地生成第三對二硫鍵合成了1(Scheme 1)。氧化反應(yīng)過程用MS和HPLC監(jiān)測。

Scheme1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

S HIMADZU LCMS-2020型質(zhì)譜儀;Shimadzu LC-10AT型高效液相色譜儀(HPLC, SPD-10A VP紫外可變波長檢測器,日本LC-10ATVP泵);多肽合成反應(yīng)柱，玻璃材質(zhì)，定制;瑞江RJ-TDL-40B低速臺(tái)式離心機(jī)。

保護(hù)氨基酸：Fmoc-Cys(trt)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH; 1-羥基苯并三氮唑(HOBt), 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU),二異丙基乙胺(DIEA), Fmoc-Linker-MBHA-Resin樹脂,吉爾生化(上海)有限公司;二氯甲烷(DCM),乙二硫醇(EDT),對甲苯酚,苯甲硫醚,吡啶,三氟乙酸(TFA),茚三酮,苯酚,乙醚,碘,硫代硫酸鈉,二甲基甲酰胺(DMF),乙腈,分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 1的固相合成[6～8]

(1) 樹脂的連接

在多肽合成反應(yīng)柱中加入Fmoc-Linker-MBHA-Resin樹脂1 g(0.28 mmol·L-1),用DCM溶脹，抽干，加入20%(體積分?jǐn)?shù),下同)吡啶/DMF溶液,振蕩反應(yīng)20 min。脫除Fmoc基團(tuán)，用DMF洗滌9遍，抽干。加入Fmoc-Cys(trt)-OH 320 mg的DMF(10 mL)溶液,TBTU 217 mg, HOBT 85 mg和DIEA 0.17 mL，氮?dú)庹袷幏磻?yīng)1 h。用DMF洗滌樹脂除去多余的Fmoc-Cys(trt)-OH制得連接樹脂。

(2) 線性肽鏈的合成

脫除Fmoc保護(hù)基：向裝有連接樹脂的反應(yīng)柱中加入20%吡啶/DMF溶液10 mL，振蕩反應(yīng)20 min。抽干，用DMF沖洗樹脂9遍。

形成肽鍵：向反應(yīng)柱中加入定量的保護(hù)氨基酸(用DMF 10 mL溶解，加入定量的TBTU和DIEA),氮?dú)庹袷幏磻?yīng)1 h。抽干，用DMF洗滌6遍。

肽鏈延長：將前一步合成的樹脂肽作為下一步合成的氨基組分，重復(fù)上述接肽過程，進(jìn)行25次接肽反應(yīng)制得樹脂線性肽鏈。

檢測反應(yīng)進(jìn)程：用茚三酮顯色法定性檢測反應(yīng)進(jìn)程，判斷各步接肽的終點(diǎn)。第一步脫除Fmoc保護(hù)基中若樹脂肽呈藍(lán)色，表明Fmoc保護(hù)基已脫除。第二步形成肽鍵步驟中若樹脂肽呈藍(lán)色，表明反應(yīng)不完全，需再次縮合。當(dāng)樹脂肽呈無色透明狀，表示縮合反應(yīng)已完成。

(3) 樹脂線性肽鏈的切割

在單口燒瓶中加入干燥的樹脂線性肽鏈,TFA 16.5 mL, EDT 1 mL,對甲苯酚1 mL,苯甲硫醚0.5 mL和水1 mL,攪拌下于20 ℃反應(yīng)2 h。抽濾，濾餅用少量TFA洗滌2次，洗液與濾液合并，用無水乙醚(5倍～10倍量)析晶，離心分離，沉淀用少量無水乙醚洗滌，真空干燥得2粗肽。

(4)2的分離純化[9]

HPLC純化條件：21.4 mm×250 mm C18柱，粒徑5 μm，檢測波220 nm。洗脫液A： 0.1%TFA水溶液；洗脫液B： 0.1%TFA乙腈溶液；選擇洗脫梯度10%～100%，洗脫時(shí)間15 min，流速1 mL·min-1。2粗肽經(jīng)HPLC純化制得2，分子量2 787.18，純度91%(HPLC，下同); MSm/z: 558.20{[M+5H]5+}, 697.50{[M+4H]4+}, 929.75{[M+3H]3+}。

1.3 1的合成

(1) 第一步氧化形成兩對二硫鍵[10～15]

在燒杯中加入2，純水100 mL，用氨水調(diào)至pH 8左右,攪拌下于室溫反應(yīng)24 h。濃縮制得3粗肽，經(jīng)HPLC純化制得3，分子量2 784.18，純度95%; MSm/z: 557.60{[M+5H]5+}, 696.55{[M+4H]4+}, 929.10{[M+3H]3+}。

(2) 第二步氧化形成第三對二硫鍵[16～21]

在單口燒瓶中加入純肽，25%甲醇溶液和碘8 eq,攪拌下于室溫反應(yīng)2 h。滴加硫代硫酸鈉至溶液無色，濃縮制得1粗肽，經(jīng)HPLC純化制得1，分子量2 639.18，純度95%; MSm/z: 528.80{[M+5H]5+}, 660.70{[M+4H]4+}, 880.55{[M+3H]3+}。

2 結(jié)論

對齊考諾肽線性肽采用Fmoc保護(hù)合成策略，使用TBTU/HOBT/DIEA作為肽的縮合劑，先用Trt保護(hù)1，8，16，20-位的兩對巰基。第一步采用空氣氧化法氧化形成兩對二硫鍵，氧化條件溫和，得率(34%)較高。第二步用碘氧化15，25-位用Acm保護(hù)的巰基形成第三對二硫鍵，經(jīng)HPLC分離成功地得到齊考諾肽，純度95%。

[1] 王德心. 固相有機(jī)合成——原理及應(yīng)用指南[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004.

[2] 戴秋云,陳添彌,黃翠芬.ω-芋螺毒素研究進(jìn)展[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,1997,21(3):223.

[3] 劉風(fēng)云,戴秋云等. SO3一種新型具有鎮(zhèn)痛活性的芋螺多肽[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2001,25(3):174-176.

[4] 周艷榮,戴秋云. 肽合成中多對二硫鍵的形成策略及分析方法[J].生物技術(shù)通訊,2002,13(3):232-233.

[5] 王良友,潘和平,陳正英. 多肽合成中幾種形成二硫鍵方法的介紹[J].有機(jī)化學(xué),1998,18:576-580.

[6] 周艷榮,劉鳳云,戴秋云.ω-芋螺毒素及其衍生物的合成[J].中國生物工程雜志,2003,23(3):72-76.

[7] Annis I, Chen L, Barany G.Novel solid-phase reagentsfor facile formation of intramoleculer disulfide bridges in peptides under mild condition[J].Journal of the American Chemical Society,1998,120:7226.

[8] Gray W R. Echistatin disulfide bridges:Selectiver eductionand linkage[J].Protein Science,1993,2:1749.

[9] Chung D, Gaur S, Bell J R. Determinationof disulfide bridge pattern[J].International Journal of Peptide and Protein Research,1995,46:320.

[10] Gray W R. Disulfide structures of highly bridged pephde:A new strategy for analysis[J].ProteinScience,1993,2:1732.

[11] Nitti G, Orru S, Bloch C Jr. Amino acid sequence and disulfide-bridge pattern of three y-thionins from Sorghum bicolor[J].European Journal of Biochemistry,1995,228:250.

[12] Nielsen K J, Adams D, Thomas L,etal. Structure activity relationships of omegaconotoxins MVIIA.MVIIC an d 14 loop splice hybrids at N and P/Q-type calcium channels[J].J Mol Bio1,1999,289(5):1405-1421.

[13] 戴秋云,周艷榮.ω-芋螺毒素線性肽合成方法比較[J].生物技術(shù)通訊,2000,11(3):175-178.

[14] 王賢純,梁宋平. 化學(xué)合成虎紋捕鳥蛛毒素的色譜行為及分離純化[J].色譜,2001,19(2):101-104.

[15] 袁湘林,鄒漢法,張玉奎. 基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜及其在高分子量物質(zhì)測定中的應(yīng)用[J].分析化學(xué),1998,26(2):234-238.

[16] Barlos K, Gatos D, Kutsogainni S. Solid phase synthesis of partially protected and free peptides containing disulphide bonds by simultaneous cysteine oxidation-release from 2-chlorotrityl resin[J].Int J Peptide Protein Res,1991,38(6):562-568.

[17] Creighton T E. Disulfide bond formation in proteins[J].Methods Enzymol,1984,107:305-329.

[18] Fujii N, Watanabe T, Otaka A. Studiesonpeptides CLⅥ.Synthesis of second human calcitonin generelated peptide(beta-hC-GRP) by apphcation of a new disulfide-bonding reaction with thallium(Ⅲ)trifluo-roacetate[J].Chem Pharm Bull,1987,35(12):4769-4776.

[19] Jain K K. An evaluation of intrathecal ziconotide for the treatment of chronic pain[J].Expert Opin Investig Drugs,2000,9(10):2403-2410.

[20] Lozanov V, Guanutccia C, Patthy A,etal. Synthsis and cystine/cysteinc-catalyczedoxidative folding of amaranthα-amylase inhibitoe[J].Peptide Res,1997:50-65.

[21] Chang J Y, Sehindler P, Ramseiler U,etal. The disulfide folding pathway of human epidermal growth factor[J].J Biol Chem,1995,270(16):9207.