宣 群，張玲琪，楊 娟，李玉鵬

1昆明醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)暨免疫學(xué)教研室，昆明650500;2云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650091; 3思茅師范高等?？茖W(xué)校生命科學(xué)系，普洱665000;4昆明醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，昆明650500

莪術(shù)內(nèi)生真菌產(chǎn)β-欖香烯代謝產(chǎn)物的研究

宣 群1*，張玲琪2，楊 娟3，李玉鵬4

1昆明醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)暨免疫學(xué)教研室，昆明650500;2云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650091;3思茅師范高等專科學(xué)校生命科學(xué)系，普洱665000;4昆明醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，昆明650500

從莪術(shù)內(nèi)生真菌?，F(xiàn)青霉EF03和巴恩青霉EF11的發(fā)酵產(chǎn)物中分離到抗癌藥物β-欖香烯。在莪術(shù)的微生態(tài)系統(tǒng)中，由于內(nèi)生真菌長期與植物相互作用，可能發(fā)生了“基因水平傳遞”。從而產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物。

莪術(shù)內(nèi)生真菌;次生代謝產(chǎn)物;β-欖香烯

莪術(shù)是姜黃屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)中藥。其根及根狀莖產(chǎn)生的抗癌成分β-欖香烯是一種廣譜、高選擇性的抗癌藥物。它不僅可以抑制和治療癌癥，還能有效緩解癌性疼痛;增強(qiáng)T細(xì)胞亞群的功能，改善CD+4/CD+8比例失調(diào)，促進(jìn)Th和Tc的作用;以及誘導(dǎo)改變腫瘤細(xì)胞膜HSP70蛋白合成及分布，提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，抑制腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［1］。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物不受季節(jié)氣候限制;可用發(fā)酵罐大規(guī)模重復(fù)生產(chǎn)，縮短生產(chǎn)周期，節(jié)約土地資源;可以通過育種和控制發(fā)酵條件等措施來大幅度提高其有效成分的含量。因此，利用微生物生產(chǎn)藥物前景十分廣闊。在植物微生態(tài)系統(tǒng)中，內(nèi)生真菌與宿主長期和諧相處，會產(chǎn)生復(fù)雜多樣的次生代謝產(chǎn)物［2］。1993年，Strobel等從短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)樹皮中分離到一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌［3］。由此開始了利用植物內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)抗癌活性成分新途徑的研究。本研究首次報(bào)道，從莪術(shù)根和根狀莖分別分離到一株產(chǎn)β-欖香烯的內(nèi)生真菌菌株。

1 儀器與試劑

BRUKER Avance DRX500兆(TMS內(nèi)標(biāo)，CDCl3為溶劑)核磁共振儀;GC8000型氣相色譜儀;Fisons MD800型質(zhì)譜儀。GF254薄層層析板購自青島海洋化工廠。試劑均為國產(chǎn)分析純。

對照品原料欖香烯注射液購自大連金港制藥有限公司。

2 菌種與培養(yǎng)條件

菌種:編號為EF03和EF11的菌株分別從采自云南屏邊縣新現(xiàn)鄉(xiāng)的莪術(shù)根和根狀莖中分離得到。培養(yǎng)基:改良MM液體培養(yǎng)基。菌種培養(yǎng):在500 mL的三角瓶中，裝入200 mL的改良MM液體培養(yǎng)基。用接種鉤挑取少許菌絲接種于培養(yǎng)瓶中，置于28℃搖床(108 r/min)培養(yǎng)8 d。

3 提取與檢測

過濾發(fā)酵液，把菌絲冷凍研磨，與發(fā)酵液合并后用石油醚(30～60℃)萃取;在70℃水浴中蒸餾，分別用展開劑石油醚-乙酸乙酯(99∶1);正已烷-乙醚(93∶7)進(jìn)行薄層層析。GC8000型氣相色譜儀和Fisons MD800型質(zhì)譜儀檢測代謝產(chǎn)物。

4 對照品制備

欖香烯注射液破乳萃?。?］后，按文獻(xiàn)制備對照。限于樣品量，本工作將柱層析改為薄層層析(TLC)。自制的對照品經(jīng)NMR檢測。

5 結(jié)果與討論

5.1 對照品檢測結(jié)果

經(jīng)薄層層析分離，石油醚洗脫，蒸餾并揮散溶劑后，得到較高濃度的某一組分。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.84(1H，dd，J=17.5，10.95 Hz)，4.92 (2H，dd，J=17.4，10.8 Hz)，4.84(s，2H)，4.73 (2H，d，J=8.4 Hz)，4.61(s，2H)，2.03(m，1H)，1.95(m，1H)，1.77(s，3H)，1.73(q，3H)，1.63(m，1H)，1.56(m，2H)，1.46(m，1H)，1.45(m，2H)，1.02(s，3H);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:150.5，150.5，147.9，112.3，110.0，108.4，52.9，45.9，40.1，39.9，33.1，27.0，24.9，21.2，16.8。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［5，6］。故確定，對照品中含有高濃度的β-欖香烯。

5.2 TLC檢測結(jié)果

用毛細(xì)管定量吸取對照品、發(fā)酵提取物和空白品，分別點(diǎn)樣于同一硅膠GF254板上，以不同的展開劑展開10 cm，取出晾干并顯色。結(jié)果表明，在兩種不同的展開劑石油醚-乙酸乙酯和正己烷-乙醚中，EF03和EF11的培養(yǎng)物均含有與對照品遷移率(Rf值)相同的斑點(diǎn)。表明這兩株真菌發(fā)酵產(chǎn)物中可能含β-欖香烯或其類似物。

5.3 氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)檢測結(jié)果

5.3.1 檢測條件

GC檢測條件為載氣(He)，起始溫度60℃，保持5 min，以8℃/min升至250℃，保持10 min;MS檢測條件為傳輸線溫度250℃，離子源溫度200℃，電離電壓70 eV。

5.3.2 確定了對照品β-欖香烯的化學(xué)結(jié)構(gòu)及出峰的保留時(shí)間，并以此為依據(jù)檢測EF03和EF11的代謝產(chǎn)物。

由圖1、圖2和圖3可見，在上述條件下，樣品的分離效果好。根據(jù)質(zhì)譜檢測到的特征性碎片峰，確定樣品EF03和EF11含有β-欖香烯。其原因可能是內(nèi)生真菌EF03和EF11在莪術(shù)的微生態(tài)系統(tǒng)中，長期與植物相互作用，發(fā)生了“基因水平傳遞［7］”，從而產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物。

具有相同次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑可能是由于相關(guān)基因的直接傳遞，這種傳遞可以發(fā)生在寄生生物與寄主之間或共生生物之間，經(jīng)長期直接接觸而傳遞遺傳物質(zhì)。在這一過程中，轉(zhuǎn)座因子的普遍存在及其轉(zhuǎn)座功能可能起了很大作用［7］。真菌產(chǎn)生植物藥用成分的代謝機(jī)制能促使植物更好地適應(yīng)其生態(tài)環(huán)境;同時(shí)，內(nèi)生真菌可能通過產(chǎn)生和耐受植物藥用成分以便更好地模擬宿主的化學(xué)環(huán)境，增強(qiáng)競爭能力，從而有利于真菌的生存與進(jìn)化。在長期共同生活過程中，內(nèi)生真菌與宿主植物關(guān)系密切。在一定條件下，真菌可刺激植物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物;宿主也可能將其部分遺傳物質(zhì)或信息傳遞給真菌，使真菌在一定程度上具有與宿主相同或相似的代謝途徑，導(dǎo)致真菌產(chǎn)生某些特定物質(zhì)。研究者才能從藥用植物中篩選出特殊的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分。

1 Yuan J(袁靜)，Wang PQ(王平全).Pharmacology and clinical application of elemene.China Pham(中國藥房)，1998，9:230-231.

2 Janice EK.Cooke.From the inside out:fungal endophytegrass associations and grassland communities.New Phytologist，2007，173:667-669.

3 Strobel G，Stierle A，Stierle D，et al.Taxomyces andreanae，a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with pacific yew(Taxus brevifolia).Mycotaxon，1993，47: 71-80.

4 Xie JH(謝繼紅)，Hou LJ(侯麗娟)，Wang Y(王瑜).The Quality standard of elemene.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2001，32:419-420.

5 Kim D，Lee J，Chang J，et al.Stereoselective synthesis of (±)-β-elemene by a doubly diasterodifferentiating internal alkylation:a remarkable difference in the rate of enolization between syn and anti esters.Tetrahedron，2001，57:1247-1252.

6Guo YT(郭永沺)，Wu XY(吳秀英)，Chen YR(陳玉仁).Isolating and identifying of elemene from the naphtha of Curcuma wenyujin.Bull Chin Mater Med(中藥通報(bào))，1983，8 (3):31.

7 Pennisi E.Is it time to uproot the tree of life?Science，1999，284:1305-1307.

β-Elemene from Curcuma zedoaria Endophytic Fungus

XUAN Qun1*，ZHANG Ling-qi2，YANG Juan3，LI Yu-peng41The Department of Microbiology and Immunology，Kunming Medical University，Kunming 650500，China;2School of Life Science，Yunnan University，Kunming，Yunnan，650091，China;3The Department of Life Science，Simao Teachers College，Puer 665000，China;4The Department of Chemistry，Kunming Medical University，Kunming 650500，China

β-Elemene was found in the metabolites of endophytic fungi，Penicillium frequentans(EF03)and P.baarnense (EF11)，which isolated from Curcuma zedoaria.In the microecosystem of Curcuma zedoaria，gene horizontal transmission may take place due to interaction of endophytic fungi and the plant for a long time.So endophytic fungi gave rise to the same secondary metabolites as their host.

endophytic fungi of Curcuma zedoaria;secondary metabolite;β-Elemene

1001-6880(2011)03-0473-03

2009-10-09 接受日期:2009-12-09

國家自然科學(xué)基金(39860005);云南省教育廳自然科學(xué)基金(06Y043C)

*通訊作者 Tel:871-5922857;E-mail:xuanqun650033@sina.com

Q939.92

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