曾 涵，趙淑賢，張 雷，王永疆

1新疆師范大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830054;2新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)附屬中學(xué)，烏魯木齊830052

胍乙酸殼聚糖的合成及其對(duì)黃瓜的保鮮研究

曾 涵1*，趙淑賢1，張 雷2，王永疆1

1新疆師范大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830054;2新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)附屬中學(xué)，烏魯木齊830052

以自制的不同脫乙酰度的殼聚糖和1-氯胍乙酸為原料合成了胍乙酸殼聚糖，研究了胍乙酸殼聚糖對(duì)黃瓜的保鮮效果。結(jié)果表明，由脫乙酰度為96%的殼聚糖制得的胍乙酸殼聚糖平均分子量為5287。隨著脫乙酰度的增加，黃瓜失重率的增加逐漸減緩，隨著貯存時(shí)間延長總?cè)~綠素含量先升高然后緩慢下降，而維生素C含量則一直緩慢下降;脫乙酰度為96%的殼聚糖制得的胍乙酸殼聚糖貯存35 d后，黃瓜的質(zhì)量損失為0.7%;貯存20 d后，總?cè)~綠素含量仍然可達(dá)1.34 mg/g;貯存時(shí)間20 d后，維生素C含量可達(dá)0.18 mg/g。

胍乙酸殼聚糖;黃瓜;涂膜;保鮮

殼聚糖由于安全，無毒副作用且成膜性好，目前已經(jīng)應(yīng)用于辣椒、番茄、草莓等的保鮮研究［1-5］。歐春艷等［6］首先研究了不同脫乙酰度的殼聚糖對(duì)黃瓜的保鮮效果，但是在保存7 d之后，黃瓜的性狀便發(fā)生了明顯改變，可見殼聚糖保鮮能力有限。胍基本身具有良好的生物相容性，胍乙酸又是一種具有較好生理活性的有機(jī)物，在生理?xiàng)l件下處于完全質(zhì)子化狀態(tài)，是形成配體和受體、酶和底物之間氫鍵、靜電力等相互作用的基礎(chǔ)，但其對(duì)細(xì)胞表面缺乏親和力，在細(xì)胞表面無法成膜，吸濕保濕性能不穩(wěn)定［7］。前文［8］結(jié)合這二者的優(yōu)點(diǎn)，合成了既具有良好的吸濕保濕性，又具有良好生理活性的胍乙酸殼聚糖(GAAC)。在此基礎(chǔ)上，采用以微波加熱代替常規(guī)加熱制備得到的殼聚糖并進(jìn)行胍乙酸化，研究了胍乙酸殼聚糖涂膜處理后的黃瓜失重率，總?cè)~綠素含量及維生素C含量等隨著貯存時(shí)間的變化關(guān)系，類似研究目前尚未見報(bào)道。經(jīng)胍乙酸殼聚糖接枝物涂膜處理，黃瓜貯存35 d后失重率僅為0.7%，不到文獻(xiàn)［6］報(bào)道的一半;貯存20 d后，總?cè)~綠素含量仍然可達(dá)1.34 mg/g，維生素C含量可達(dá)到0.18 mg/g，而文獻(xiàn)［6］報(bào)道的脫乙酰度為90%的殼聚糖涂膜處理，黃瓜貯存20 d后總?cè)~綠素含量僅有0.7 mg/g，維生素C含量僅有0.11 mg/g。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

WP-750A型微波爐，WNZK-01溫度控制儀，NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)，將干燥試樣溶解于0.1 mol/L NaCl溶液中，按一點(diǎn)法進(jìn)行特性粘度的測定;76型電動(dòng)攪拌機(jī)，AL104數(shù)字式電子天平(德國梅特勒公司)，BRUKER EQUINDX-55型紅外光譜儀(德國 BRUKER公司)，KBr壓片;JEOL JNMECP600M型核磁共振儀(日本JEOL公司)，溶劑D2O，TMS為標(biāo)樣;Y-4Q型X-射線衍射儀(荷蘭飛利浦公司);PHS-25型PH計(jì)(上海雷磁儀器廠); DDS-L型電導(dǎo)率儀(深圳市統(tǒng)奧科技有限公司); Waters(Model510)凝膠滲透色譜儀(GPC)(美國Waters公司)，流動(dòng)相為THF(四氫呋喃)，用窄分布的聚苯乙烯樣品作為標(biāo)樣。

1-氯胍乙酸、NaOH、HCl、草酸、高錳酸鉀、甘氨酸、丙酮、甲醛、冰乙酸、溴乙烷、硫脲、紅磷和乙醚均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 殼聚糖的制備

將10 g經(jīng)過水洗后的蝦殼用200 mL 2 mol/L NaOH溶液浸泡，用320W功率的微波輻照5 min后，冷至室溫浸泡12 h，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%NaCl溶液浸泡4 h后沖洗，除去蝦殼中的蛋白質(zhì)，重復(fù)此步驟3～4次后用水洗至中性，再用250 mL 2 mol/L HCl溶液在室溫下浸泡24 h，使碳酸鈣轉(zhuǎn)化為氯化鈣，用水洗至中性，干燥，粉碎后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的高錳酸鉀溶液，浸泡1 h脫色，水洗后以質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%～70%草酸處理20 min，得白色片狀結(jié)晶甲殼素。

將甲殼素在35%的NaOH溶液中用500W功率微波輻照10 min，得到脫乙?；臍ぞ厶?，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%稀醋酸將其溶解，過濾去除雜質(zhì)后，濾液中加入堿，析出殼聚糖。粗甲克素按上述步驟處理不同時(shí)間可得不同脫乙酰度的殼聚糖:處理時(shí)間分別為4.3、5.2、6.4、7.9和9.4 h時(shí)可分別得到脫乙酰度為30、50、70、90和96%的殼聚糖。

農(nóng)村經(jīng)濟(jì)是社會(huì)經(jīng)濟(jì)穩(wěn)步發(fā)展的主要推動(dòng)力，在新農(nóng)村建設(shè)中，群眾的生活水平得到了顯著提高，但也出現(xiàn)了影響新農(nóng)村建設(shè)的不利因素，其中農(nóng)村人畜用水安全就是影響新農(nóng)村建設(shè)的主要因素之一?，F(xiàn)階段我國農(nóng)村普遍存在水資源短缺的現(xiàn)象，雖然我國農(nóng)村地區(qū)已經(jīng)修建了一些人畜飲水工程，但是由于管理不力等方面的因素，人畜飲水工程的效益并沒有得到充分發(fā)揮。

1.2.2 胍乙酸殼聚糖合成

按文獻(xiàn)［8］方法合成。合成步驟簡述如下:稱取約3.8 g干燥殼聚糖固體，加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的NaOH溶液堿化，再依次加入約20 mL異丙醇及1-氯胍乙酸3.0 g，室溫反應(yīng)2 h，并不時(shí)攪拌，待殼聚糖固體緩慢溶解后再加熱2 h(溫度保持在70℃)，攪拌下冷卻至室溫(約30 min)，加無水冰醋酸調(diào)pH至中性，有白色粘稠狀固體生成，充分?jǐn)嚢瑁訜o水乙醚攪拌，抽濾，于80℃烘箱內(nèi)干燥，研碎得白色胍乙酸殼聚糖粉末(以不同脫乙酰度的殼聚糖為原料與1-氯胍乙酸反應(yīng)可得不同脫乙酰度的胍乙酸殼聚糖)。

1.2.3 脫蛋白質(zhì)量的測定

采用甲醛滴定氨基氮法［9］用pH計(jì)測得微波脫蛋白液中氨基氮含量為1.642 g/L。

1.2.4 脫乙酰度的測定

以電導(dǎo)率為縱坐標(biāo)，NaOH溶液的消耗量(mL)為橫坐標(biāo)作圖，通過一階，二階微分求拐點(diǎn)，按文獻(xiàn)［10］方法求出殼聚糖的脫乙酰度。

1.2.5 失重率測定

稱取不同脫乙酰度的GAAC各1.0000 g，加入100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的稀醋酸溶液，攪拌溶解后得10 g/L的GAAC溶液。將黃瓜隨機(jī)分組，每組5個(gè)，分別將配好的涂膜液覆于黃瓜表面，涂抹均勻，然后把黃瓜放在通風(fēng)處，自然風(fēng)干，稱重，用保鮮袋裝好，室溫下貯藏。

1.2.6 葉綠素含量測定

按下式［11］求得總?cè)~綠素含量:

式中A為吸光度，m為所用鮮黃瓜表皮質(zhì)量(g)，V為葉綠素丙酮提取液的體積(mL)

1.2.7 維生素C含量測定

圖1 殼聚糖脫乙酰度隨處理時(shí)間的變化關(guān)系Fig.1 Relation between chitosan deacetylation and disposal durance

用微波消解不同脫乙酰度的殼聚糖涂膜液處理過的黃瓜，用間接碘量法［12］測定其中維生素C含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 胍乙酸殼聚糖(GAAC)的結(jié)構(gòu)分析

殼聚糖的脫乙酰度測定結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出:在起始的4 h內(nèi)，反應(yīng)很慢，隨著處理時(shí)間的延長，脫乙酰度迅速增加，10 h以后甲殼素上的乙?；呀?jīng)基本上被脫除。

GAAC:IR(KBr)υ/cm-1:3480(N-H);1425，1621(COO-);1560(guanyl);924(sugar ring，C1-H)。1H NMR δ:3.4～4.2(m，5H，sugar ring 2，3，4，5，6-H);4.46～5.06(m，3H，sugar ring-OH);9.70 (d，J=9.0 Hz，1H，NH);4.56(t，J=9.3 Hz，1H，sugar C1-H)。殼聚糖的XRD圖譜中2θ為10°、18°、45°、66°和79°處有5個(gè)強(qiáng)結(jié)晶峰。GAAC的XRD圖譜上，只有20°和47°的2個(gè)弱峰，其強(qiáng)度只有殼聚糖XRD圖譜中與之相接近的18°和45°峰強(qiáng)度的31%和44%;殼聚糖的其余結(jié)晶峰全部消失，說明引入的胍基破壞了殼聚糖的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，這也是GAAC水溶性增高的原因。

按照文獻(xiàn)［13］方法測得由脫乙酰度為96%的殼聚糖制備的 GAAC的聚合度為8.51，取代度為0.43，炭化點(diǎn)≥186℃，測得粘度為292 mPa.s，由GPC測得分子量為5287，分子量分布指數(shù)為2.31，GAAC在水中的溶解度(25℃)為:0.41 g·L-1。其分子結(jié)構(gòu)如圖2所示:

圖2 GAAC分子結(jié)構(gòu)圖示Fig.2 Diagram of GAAC molecular structure

2.2 黃瓜的質(zhì)量損失率

黃瓜失重率計(jì)算方法公式:質(zhì)量損失%=(mo–mt)/mo×100%。式中mo和mt分別為黃瓜的原始質(zhì)量和每天稱重的質(zhì)量(g)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 黃瓜失重率與貯存時(shí)間的關(guān)系Fig.3 Relation between storage durance and weightloss.Deacetylation/%:1.0，2.30，3.50，4.70，5.90，6.96

由圖3可以看出:各涂膜組黃瓜的失重率均低于對(duì)照組，其中經(jīng)脫乙酰度高的涂膜液處理的黃瓜失重率最低。在低臨界溶解溫度和動(dòng)態(tài)接觸濃度之下，GAAC分子可以有效地吸附在細(xì)胞表面而不會(huì)被細(xì)胞吸收，達(dá)到抑制水分流失的作用。此外，GAAC的抑菌作用也增強(qiáng)了保鮮效果［14］。文獻(xiàn)［6］報(bào)道以脫乙酰度為85%的殼聚糖涂膜的黃瓜貯存20 d后失重率可達(dá)1.6%，而本文合成的胍乙酸殼聚糖(其中作為原料的殼聚糖脫乙酰度為96%)作保鮮劑給黃瓜涂膜，貯存35 d后的失重率僅為0.7%。

2.3 黃瓜中葉綠素含量的變化

圖4 貯存時(shí)間對(duì)黃瓜葉綠素含量的影響Fig.4 Influence of storage durance on total concentration of Chlorophyll in cucumber.Deacetylation/%:1∶0，2∶30，3∶50，4∶70，5∶90，6∶96

黃瓜葉綠素含量隨貯存期的變化見圖4，可以看出隨著貯藏時(shí)間增長，對(duì)照組的葉綠素含量逐漸減少，而經(jīng)涂膜處理過的黃瓜中的葉綠素含量則會(huì)先顯著上升而后逐漸下降。這是因?yàn)辄S瓜在用GAAC涂膜保鮮時(shí)，類似于微環(huán)境下的MA(Modified atmosphere)保藏，膜內(nèi)的CO2含量隨時(shí)間延長而增加，從而減緩葉綠素的降解。葉綠素酶活性中心與GAAC可能通過螯合或氫鍵作用相結(jié)合使酶活性中心構(gòu)象發(fā)生扭曲，導(dǎo)致酶活力下降(與GAAC結(jié)合后的葉綠素酶的活性降低為游離葉綠素酶活性的30%［14-16］);同時(shí)這種酶和GAAC的選擇性結(jié)合也增大了底物葉綠素與酶空間上的分隔，從而阻止了葉綠體膜的崩潰瓦解，這意味著單位時(shí)間和體積內(nèi)葉綠素降解速度顯著減慢，表觀上測定的葉綠素濃度便“上升”了。文獻(xiàn)［6］報(bào)道當(dāng)以脫乙酰度為90%的殼聚糖涂膜黃瓜表面，貯存20 d后測得的總?cè)~綠素含量下降到0.7 mg/g，而以胍乙酸殼聚糖(其中作為原料的殼聚糖的脫乙酰度為96%)作為保鮮劑給黃瓜涂膜貯存20 d后，總?cè)~綠素含量為1.34 mg/ g。

2.4 黃瓜中維生素C含量的變化

圖5 黃瓜中維生素C含量與貯存時(shí)間的關(guān)系Fig.5 Relation between storage durance and content of Vitamin C in cucumber.Deacetylation/%∶1∶0，2∶30，3∶50，4∶70，5∶90;6∶96

黃瓜中維生素C含量隨貯存時(shí)間的變化見圖5?？梢钥闯?隨著貯藏時(shí)間的延長，涂膜組和對(duì)照組的維生素C含量都明顯減少，但經(jīng)GAAC涂膜后黃瓜中維生素C含量的降低速率明顯低于對(duì)照組。這是由于GAAC涂膜顯著地減少了黃瓜體內(nèi)外的氣體交換，從而使維生素C的損失減少。覆蓋于細(xì)胞表面的GAAC分子可形成有效的保護(hù)膜，部分抑制了電子在細(xì)胞膜內(nèi)外的遷移并導(dǎo)致維生素C的峰電流下降，電位也發(fā)生相應(yīng)的變化［16］。綜上所述，隨著殼聚糖的脫乙酰度提高保鮮劑的保鮮效果增強(qiáng)，這可以解釋為:一方面是由于脫乙酰度的提高使游離NH2基團(tuán)增多，從而可連接更多的胍乙酸基。胍乙酸基團(tuán)中C=N鍵對(duì)鄰近N原子的強(qiáng)烈吸電子作用，使其更容易被親核性細(xì)胞膜吸附，另一方面則是因?yàn)檫B接的胍乙酸基越多，改變了葉綠素酶的空間結(jié)構(gòu)，使其翻譯后修飾步驟受到阻礙，導(dǎo)致降解速度下降從而起到保鮮作用［15，16］。另外，此種保鮮劑的保鮮效果要超過文獻(xiàn)［6］報(bào)道的同樣條件下脫乙酰度為90%的殼聚糖對(duì)黃瓜的保鮮效果大約50%。文獻(xiàn)［6］報(bào)道的以脫乙酰度為90%的殼聚糖涂膜黃瓜表面，貯存20 d后測得的維生素C含量僅為0.11 mg/g，而以脫乙酰度為96%的殼聚糖為原料制備的胍乙酸殼聚糖作保鮮劑給黃瓜涂膜后貯存20 d后，測定的黃瓜中維生素C含量為0.18 mg/g。這是因?yàn)?一方面GAAC分子可以憑借多個(gè)基團(tuán)的氫鍵，靜電引力等作用相對(duì)于殼聚糖分子而言更穩(wěn)定地吸附于細(xì)胞膜表面;另一方面則是胍乙酸基與葉綠素酶基因中N端的序列發(fā)生作用，改變了葉綠素酶翻譯后修飾的歷程，從而改變了葉綠素的降解速度［15，16］。

1Sun XL(孫曉麗)，Xin MH(辛梅華)，Li MC(李明春). Preparation of N，N-dilauryl chitosan.Chem Ind Eng Prog (化工進(jìn)展)，2006，25:1095-1097.

2 Garcia MA，Pinotti A，Martino M.Electrically treated composite FILMS based on chitosan and methylcellulose blends. Food Hydrocoll，2009，23:722-728.

3 Molvinger K，Quignard F，Brunel D.Porous chitosan-Silica hybrid microspheres as a potential catalyst.Chem Mater，2004，16:3367-3372.

4 H?hne S，F(xiàn)renzel R，Heppe A.Hydrophobic chitosan microparticles:heterogeneous phase reaction of Chitosan with hydrophobic carbonyl reagents.Biomacromolecules，2007，8:2051-2058.

5 Ling PX(凌沛學(xué))，Rong XH(榮曉花)，Zhang TM(張?zhí)烀?.Medical developments of chitosan and its derivates. Foods＆Drugs(食品與藥品)，2008，10(9):69-71.

6 Ou CY(歐春艷)，Li SD(李思東)，Yang L(楊磊).The effect of different deacetylation of chitosan on cucumbers preservation.Guangzhou Chem Ind(廣州化工)，2008，36: 31-33.

7Cao YJ(曹玉娟)，Gao HX(高海翔)，Lu RH(魯潤華). Progressing in the synthesis of guanidines.Chin J Synth Chem(合成化學(xué))，2003，3:193-202.

8 Zeng H(曾涵)，Zhang L(張雷).Synthesis of guanidyl acetic acid chitosan and measurement of its hydroscopic and moisture retention.J Xinjiang Norm Univ，Nat Sci(新疆師范大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2008，27:83-86.

9 Yang JS(楊繼生)，Zhang M(張明).Preparation of chitosan with microwave technology.Chem Eng(化學(xué)工程師)，1995 (5):14-15.

10 Tea Indest，Janne Laine，Leena-Sisko Johansson，et al.Adsorption of fucoidan and chitosan sulfate on chitosan modified PET films monitored by QCM-D.Biomacromolecules，2009，10:630-637.

11 Wu ZJ(吳仲幾).Experiment of Food Chemistry(食品化學(xué)實(shí)驗(yàn))，Guangzhou:The Press of Jinan University，1995.85-88.

12 Wang YX(王云霞)，Zhang HQ(張會(huì)輕).The discussion of titrimetric method of vitamin C content.Hebei Chem Eng Ind (河北化工)，2008，31(8):72-73.

13 Su ZF(蘇志鋒)，Yu XL(于曉琳)，Zhao YM(趙耀明). Study of the graft copolymer of cellulose diacetate with L-lactide.Chem Res Appl(化學(xué)研究與應(yīng)用)，2008，20:1101-1104.

14 Shi HF(史合方)，Cao LH(曹玲華).Synthesis and biological activity of N-Alkyl/aryl-N'-(4-arylthiazol-2-yl)-N"-glycosyl Guanidines.Chin J Org Chem(有機(jī)化學(xué))，2005，25: 1066-1070.

15 Yang XT(楊曉棠)，Zhang ZQ(張昭其)，Xu LY(徐蘭英)，et al.Plant chlorophyll degradation.Plant Physiol Commun (植物生理學(xué)通訊)，2008，34:7-14.

16 Harpaz-Saad S，Azoulay T.Chlorophyllase is a rate-limiting enzyme in chlorophyll catabolism and is posttranslationally regulated.Plant Cell，2007，19:1007-1022.

Synthesis of Guanidyl Acetic Acid Chitosan And Preservation Effect of Cucumbers

ZENG Han1*，ZHAO Shu-xian1，ZHANG Lei2，WANG Yong-jiang11College of Life Science and chemistry，Xing Jiang Normal University，Urumuqi 830054，China;2Accessory Middle School of Xin Jiang Agricultural School，Urumuqi 830052，China

Guanidyl acetic acid chitosan(GAAC)has been synthesized by self-made chitosan and chloro-guanidinyl acetate as raw materials and was used as cucumber preservative.The results from experiment indicated average molecular weight of guanidyl acetic acid chitosan prepared from chitosan with deacetylation of 96%was 5287 g/mol.Effects of coating with a series of different deacetylation of GAAC as fresh-keeper for cucumber stored at room temperature had been examined.Weight-loss rate slowed down gradually with increase of chitosan deacetylation.Consistency of total chlorophyll increases first and then decreases gradually while storage period lapses.In contrast，concentration of vitamin C declines slightly while storage duration prolongs.When storage duration of GAAC prepared from chitosan with deacetylation of 96%is 35 d，weight-loss rate is about 0.7%;storage duration:20 d，concentration of total chlorophyll still amounts to 1.34 mg/g;while consistency of vitamin C can retain 0.18 mg/g，storage duration 20 d.

guanidyl acetic acid chitosan(GAAC);cucumber;coating film;fresh-keeping

1001-6880(2011)03-0504-05

2010-01-05 接受日期:2010-04-27

*通訊作者 E-mail:zenghan1289@163.com

O636.1

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