蔡 炯，牛 娜，李 方，王世真

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京 100730

·論著·

腺相關(guān)病毒介導(dǎo)β淀粉樣肽單鏈抗體對(duì)動(dòng)物阿爾茨海默病的治療效果

蔡 炯，牛 娜，李 方，王世真

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京 100730

目的觀察攜帶β淀粉樣肽單鏈抗體基因的腺相關(guān)病毒對(duì)阿爾茨海默病動(dòng)物模型的治療效果。方法給突變淀粉樣蛋白前體轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠腿部肌肉注射攜帶Aβ單鏈抗體基因的腺相關(guān)病毒，在藥物注射前和注射后3、7、10個(gè)月用Morris水迷宮測(cè)定潛伏期，并在藥物注射后10個(gè)月取大腦做組織切片，行免疫組織化學(xué)染色，觀察淀粉樣斑塊在海馬的沉積。結(jié)果注射基因治療藥物后3個(gè)月，阿爾茨海默病模型小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力明顯改善，注射基因治療藥物后10個(gè)月，模型小鼠海馬淀粉樣斑塊的沉積減少。結(jié)論肌肉注射攜帶Aβ單鏈抗體基因的腺相關(guān)病毒對(duì)阿爾茨海默病模型有治療作用。

阿爾茨海默病;腺相關(guān)病毒;β淀粉樣肽;單鏈抗體

β淀粉樣肽(amyloid β peptide, Aβ)在大腦組織的過(guò)載是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)發(fā)病的主要原因[1]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明針對(duì)Aβ的主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫都可以清除AD動(dòng)物大腦組織內(nèi)過(guò)量的Aβ[2-3]。但臨床研究顯示，Aβ的免疫接種極有可能引起腦脊膜炎，這種副作用可能和T細(xì)胞或抗體恒定區(qū)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)[4-6]。有研究從人類(lèi)單鏈抗體噬菌體文庫(kù)中篩選出了Aβ的單鏈抗體基因并制備了攜帶該基因的重組腺相關(guān)病毒[7-11]。本研究利用較為成熟的突變淀粉樣蛋白前體(mutant amyloid precursor protein,APP)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型測(cè)試該基因藥物對(duì)AD的治療效果。

材料和方法

材料重組腺相關(guān)病毒rAAV2/1-Abeta-scFv為本實(shí)驗(yàn)室研制。APP轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所引進(jìn)。引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，序列為P1:GTCACCCCTAGTTCTTTTT; P2:GGTAGACTTCTTGGCAATAC; R1:CC- GATGATGACGAGGACGAT； R2：TGAACACGTGACG- AGGCCGA。蛋白酶K購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司。

轉(zhuǎn)基因和對(duì)照背景小鼠的PCR鑒定基因型鑒定時(shí)先剪取0.5～1 cm鼠尾置于微量離心管，加入0.5 ml鼠尾裂解液(100 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、200 mmol/L NaCl、0.2% SDS、 pH 8.0)，再加入20 mg/ml 蛋白酶K 2.5 μl至終濃度100 μg/ml, 50℃振搖過(guò)夜。次日，離心，棄蛋白酶消化所剩的殘?jiān)Ｔ谏锨逡褐屑尤?.5 ml異丙醇顛倒混勻，待DNA析出后，離心棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀1次，晾干沉淀。沉淀溶于200 μl Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)，65℃保溫1 h后將DNA完全溶解，-80℃凍存。隨后分別取提取物0.5 μl加入到PCR體系中，94℃變性、58℃退火、72℃延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳。

動(dòng)物分組與Morris水迷宮測(cè)試將轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠24只按雌雄隨機(jī)分成兩組: APP(+)AAV1-scFv基因治療組和APP(+)AAV1-增強(qiáng)綠色熒光蛋白 (enhanced green fluorescent protein, EGFP)對(duì)照治療組，每組12只，雌雄各半。APP(-)正常對(duì)照組(與轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠遺傳背景相同的小鼠，年齡相同)12只，雌雄各半。動(dòng)物10月齡時(shí)，用Morris水迷宮測(cè)試動(dòng)物的潛伏期，測(cè)試時(shí)間持續(xù)2.5 d，分別在前兩天的上午和下午、第3天上午的同一時(shí)間進(jìn)行。水池直徑80 cm，平臺(tái)低于水面1.5 cm，加入奶粉溶于水中隱蔽平臺(tái)，水溫控制在(25±1)℃。

基因藥物注射與Morris水迷宮測(cè)試第1次水迷宮測(cè)試完畢后第2天對(duì)基因治療組小鼠和對(duì)照治療組小鼠分別注射4×1010拷貝AAV1-scFv(溶于100 μl PBS，肌肉注射)和4×1010拷貝AAV1-EGFP(溶于100 μl PBS，肌肉注射)。APP(-)正常對(duì)照組小鼠注射100 μl PBS，所有注射部位均為右股四頭肌。分別于注射藥物后3、7、10 個(gè)月，動(dòng)物達(dá)到13、17、20個(gè)月齡時(shí)，用Morris水迷宮測(cè)試動(dòng)物的潛伏期。

EGFP和scFv表達(dá)的組織學(xué)觀察注射基因藥物后10個(gè)月，用10%水合氯醛過(guò)量麻醉動(dòng)物，灌流固定后取動(dòng)物的肌肉組織進(jìn)行冰凍切片，直接在熒光顯微鏡下觀察，或進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后觀察。

老年斑的檢測(cè)注射基因藥物后10個(gè)月，用10%水合氯醛過(guò)量麻醉動(dòng)物，灌流固定后取動(dòng)物的腦組織進(jìn)行冰凍切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后觀察基因治療對(duì)大腦海馬老年斑沉積的影響。選用6E10單克隆抗體為一抗，辣根過(guò)氧化物酶羊抗小鼠抗體為二抗，DAB顯色。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理行為學(xué)測(cè)試數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SPSS 10.0軟件，組間采用ANOVA分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

PCR鑒定結(jié)果PCR結(jié)果顯示24只入選的AD模型小鼠帶有APP基因(1～12號(hào)和19～30號(hào))，經(jīng)引物R1、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物大小574 bp(圖1A)；經(jīng)引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物大小692 bp(圖1B)；而正常對(duì)照組的12只動(dòng)物無(wú)APP基因(13～18號(hào)，31～36號(hào))。

Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示10月齡轉(zhuǎn)基因APP(+) AD模型小鼠和APP(-) 同背景正常動(dòng)物相比，其第1次尋找隱匿平臺(tái)所用時(shí)間顯著延長(zhǎng)，動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力降低，但第2～5次尋找隱匿平臺(tái)所用時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，動(dòng)物的記憶能力無(wú)變化。給藥3個(gè)月后，APP(+)AAV1-scFv基因治療組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力接近APP (-)同背景正常對(duì)照組小鼠，而和APP(+)AAV1-EGFP對(duì)照治療組小鼠相比，其第1次尋找隱匿平臺(tái)所用時(shí)間顯著縮短，動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力改善[(57±30)s 比(89±35)s,P<0.05]；第5次尋找隱匿平臺(tái)所用時(shí)間顯著縮短，動(dòng)物的記憶能力得以改善[(31±19)s 比(63±30)s,P<0.05]。給藥7個(gè)月后，APP(+)AAV1-scFv基因治療組小鼠的記憶能力和APP(+)AAV1-EGFP對(duì)照治療組小鼠相比，第5次尋找隱匿平臺(tái)所用時(shí)間顯著縮短[(34±12)s 比(47±15)s,P<0.05]。給藥10個(gè)月后，APP(+)AAV1-scFv基因治療組小鼠的記憶能力和APP(+)AAV1-EGFP對(duì)照治療組小鼠、APP(-)正常對(duì)照組小鼠間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。APP(+)AAV1-EGFP對(duì)照治療組小鼠第4和5次尋找隱匿平臺(tái)所用時(shí)間比APP(-)正常對(duì)照組小鼠顯著延長(zhǎng)[(43±20)s 比(28±14)s,P<0.05；(42±16)s比(27±9)s,P<0.05](表1)。

M：DL2000；1～12：APP(+)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；13：APP(-)同遺傳背景正常動(dòng)物M ：DL2000；1-12：APP(+) transgenic mice；13：APP(-) normal mice with same genetic backgroundA.引物為R1、R2的PCR結(jié)果；B.引物為P1、P2的PCR結(jié)果， A. PCR products with primers R1 and R2；B. PCR products with primers P1 and P2

EGFP和scFv的表達(dá)治療10個(gè)月后，EGFP基因主要在注射部位右股四頭肌表達(dá)，而在左股四頭肌很少表達(dá)，而注射rAAV/抗β淀粉樣肽單鏈抗體基因的基因治療組無(wú)EGFP的表達(dá)(圖2)。用單鏈抗體的c-myc小鼠單克隆抗體對(duì)肌肉樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示APP(+)AAV1-scFv基因治療組治療10個(gè)月后右股四頭肌的抗β淀粉樣肽單鏈抗體表達(dá)，左股四頭肌很少表達(dá)，而APP(+)AAV1-EGFP對(duì)照治療組無(wú)表達(dá)(圖3)。

表 1 基因治療各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠Morris水迷宮測(cè)試出的潛伏期

APP：突變淀粉樣蛋白前體；EGFP：增強(qiáng)綠色熒光蛋白 ；APP(-)：正常對(duì)照組；APP(+)AAV1-EGFP：對(duì)照治療組；APP(+)AAV1-scFv：基因治療組；和同一時(shí)間點(diǎn)APP(-)相比，aP<0.05；和同一時(shí)間點(diǎn)APP(+)AAV1-EGFP相比，bP<0.05

APP：mutant amyloid precursor protein；EGFP：enhanced green fluorescent protein；APP(-)：normal control group; APP(+)AAV1-EGFP: control gene therapy group; APP(+)AAV1-scFv: gene therapy group；aP<0.05 compared with PBS-treated APP(-) mice at the same time point;bP<0.05 compared with APP(+)AAV1-EGFP mice at the same time point

老年斑的檢測(cè)結(jié)果注射rAAV/抗β淀粉樣肽單鏈抗體基因治療AD 10個(gè)月后，淀粉樣斑塊減少，而對(duì)照治療組斑塊沉積較多(圖4)。

討 論

單鏈抗體是利用基因工程的手段將抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過(guò)一段柔性多肽相連接，保持了抗體結(jié)合抗原的特性而縮小了抗體的大小和分子質(zhì)量，一般只有全長(zhǎng)抗體的1/6大小。通過(guò)噬菌體展示和抗原篩選的方法將抗體的功能和基因有機(jī)地融合為一體[12]。AD和Aβ過(guò)載密切相關(guān)，國(guó)內(nèi)從人類(lèi)單鏈抗體噬菌體文庫(kù)中篩選出了Aβ的單鏈抗體基因，早于國(guó)外的研究[7-11]。本研究將攜帶有4×1010拷貝抗人Aβ單鏈抗體基因的1型血清腺相關(guān)病毒注射到AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠的肌肉內(nèi)，3個(gè)月后，基因治療組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力接近正常。給藥7個(gè)月后，基因治療組小鼠和對(duì)照治療組[APP(+)AAV1-EGFP]相比，雖然第5次尋找隱匿平臺(tái)所用時(shí)間顯著縮短，但治療藥物的效果已經(jīng)不如前期，可能由于治療基因是來(lái)源于人的，產(chǎn)生的人單鏈抗體引起了小鼠的抗抗體反應(yīng)，從而改變了藥物的治療效果。給藥10個(gè)月后，基因治療組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和治療對(duì)照差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明基因治療的保護(hù)作用已經(jīng)不再明顯。此時(shí)基因治療組小鼠腦內(nèi)淀粉樣沉積少于治療對(duì)照，表明淀粉樣沉積和學(xué)習(xí)記憶能力可能不是直接相關(guān)。有研究表明，和學(xué)習(xí)記憶能力直接相關(guān)的是Aβ寡聚體，而不是淀粉樣沉積[13-17]，是否給藥10個(gè)月后基因治療組和治療對(duì)照組小鼠腦內(nèi)Aβ寡聚體存在差異，值得進(jìn)一步研究。腺相關(guān)病毒注射到肌肉后，在基因治療組小鼠表達(dá)單鏈抗體，而不表達(dá)EGFP，而在治療對(duì)照組表達(dá)EGFP，而不表達(dá)單鏈抗體。不同的是單鏈抗體帶有信號(hào)肽，可以分泌入肌肉纖維間，而EGFP無(wú)信號(hào)肽，只能在肌肉纖維內(nèi)表達(dá)。可能肌肉表達(dá)的抗Aβ的單鏈抗體，最終進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)甚至進(jìn)入大腦內(nèi)，對(duì)抗Aβ寡聚體的形成和神經(jīng)毒性。

(本文圖2～4見(jiàn)插圖第3頁(yè))

[1] Yoshihara T, Takiguchi S, Kyuno A, et al. Immunoreactivity of phage library-derived human single-chain antibodies to amyloid beta conformersinvitro[J]. J Biochem, 2008, 143(4):475-486.

[2] Pride M, Seubert P, Grundman M, et al. Progress in the active immunotherapeutic approach to Alzheimer’s disease: clinical investigations into AN1792-associated meningoencephalitis[J]. Neurodegener Dis, 2008, 5(3-4):194-196.

[3] Steinitz M. Developing injectable immunoglobulins to treat cognitive impairment in Alzheimer’s disease[J]. Expert Opin Biol Ther, 2008, 8(5):633-642.

[4] Racke MM, Boone LI, Hepburn DL, et al. Exacerbation of cerebral amyloid angiopathy-associated microhemorrhage in amyloid precursor protein transgenic mice by immunotherapy is dependent on antibody recognition of deposited forms of amyloid beta[J]. J Neurosci, 2005, 25(3):629-636.

[5] Pfeifer M, Boncristiano S, Bondolfi L, et al. Cerebral hemorrhage after passive anti-Abeta immunotherapy[J]. Science, 2002, 298(5597):1379.

[6] Wilcock DM, Rojiani A, Rosenthal A, et al. Passive immunotherapy against Abeta in aged APP-transgenic mice reverses cognitive deficits and depletes parenchymal amyloid deposits in spite of increased vascular amyloid and microhemorrhage[J]. J Neuroinflamm, 2004, 1(1):24.

[7] Cai J, Wang S, Zhong Y, et al. Screening and characterization of human single-chain Fv antibody against beta-amyloid peptide 40[J]. Neuroreport, 2003, 14(2):265-268.

[8] 蔡炯，王世真，彭勇，等. 阿爾茨海默病Aβ人抗體可變區(qū)片段基因的克隆和表達(dá)[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 25(5):557-562.

[9] Liu R, Yuan B, Emadi S, et al. Single chain variable fragments against beta-amyloid (Abeta) can inhibit Abeta aggregation and prevent abeta-induced neurotoxicity[J]. Biochemistry, 2004, 43(22):6959-6967.

[10] Manoutcharian K, Acero G, Munguia ME, et al. Human single chain Fv antibodies and a complementarity determining region-derived peptide binding to amyloid-beta 1-42[J]. Neurobiol Dis, 2004, 17(1):114-121.

[11] Wang YJ, Pollard A, Zhong JH, et al. Intramuscular delivery of a single chain antibody gene reduces brain Abeta burden in a mouse model of Alzheimer’s disease[J]. Neurobiol Aging, 2009, 30(3):364-376.

[12] Cai J, Liu Z, Wang F, et al. Phage display applications for molecular imaging[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2010, 11(6):603-609.

[13] Ono K, Condron MM, Teplow DB. Structure-neurotoxicity relationships of amyloid beta-protein oligomers[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(35):14745-14750.

[14] Tomic JL, Pensalfini A, Head E, et al. Soluble fibrillar oligomer levels are elevated in Alzheimer’s disease brain and correlate with cognitive dysfunction[J]. Neurobiol Dis, 2009, 35(3):352-358.

[15] Laurén J, Gimbel DA, Nygaard HB, et al. Cellular prion protein mediates impairment of synaptic plasticity by amyloid-beta oligomers[J]. Nature, 2009, 457(7233):1128-1132.

[16] Shankar GM, Li S, Mehta TH, et al. Amyloid-β protein dimmers isolated directly from Alzheimer’s brains impair synaptic plasticity and memory[J]. Nat Med, 2008, 14(8):837-842.

[17] Mc Donald JM, Savva GM, Brayne C, et al. The presence of sodium dodecyl sulphate-stable Abeta dimers is strongly associated with Alzheimer-type dementia[J]. Brain, 2010, 133(Pt 5):1328-1341.

TherapeuticEffectofAnti-amyloidβPeptideSingle-chainAntibodyGeneMediatedbyAdeno-associatedVirusonAnimalAlzheimer’sDisease

CAI Jiong,NIU Na,LI Fang,WANG Shi-zhen

Department of Nuclear Medicine, PUMC Hospital, CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

CAI Jiong Tel: 010-65295517, E-mail: jiongcai@sina.com

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of recombinant adeno-associated virus carrying anti-amyloid β peptide single-chain antibody gene on Alzheimer’s disease (AD) in animal models.MethodsThe recombinant adeno-associated viruses were injected to the leg muscle of mutant amyloid precursor protein transgenic AD mice. The latency of the mice in Morris water maze was tested before and 3, 7, 10 months after drug administration. The animal brains were harvested 10 months after drug administration and sectioned for amyloid plaques staining.ResultsThe learning and memory abilities of AD model mice were improved significantly 3 months after gene drug administration. Ten months after gene therapy, the numbers of amyloid plaque in hippocampus of model mice decreased.ConclusionThe adeno-associated virus carrying anti-amyloid β peptide single-chain antibody gene has therapeutic effect on AD in model mice.

Alzheimer’s disease; adeno-associated virus; amyloid β peptide; single-chain antibody

ActaAcadMedSin，2011,33(2)：151-155

蔡 炯 電話:010-65295517, 電子郵件:jiongcai@sina.com

R741.05

A

1000-503X(2011)02-0151-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.02.011

國(guó)家自然科學(xué)基金(30500573，30670741)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30500573，30670741)

2010-04-19)