譚鳳霞，葉 聰 (長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院， 湖北 荊州 434025)

基于16S rDNA序列的2株氣單胞菌屬細(xì)菌的分子鑒定

譚鳳霞，葉 聰 (長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院， 湖北 荊州 434025)

對(duì)分離自患病鯽魚的2株氣單胞菌的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)定其核酸序列，通過(guò)NCBI的BLAST查找同源序列，應(yīng)用MegAlign采用Jotun Hein、ClustalV以及ClustalW 3種方法分別進(jìn)行序列比對(duì)，并利用Mega4.0軟件采用鄰接法(N-J)、最小進(jìn)化法(ME)、最大簡(jiǎn)約法(MP)、非加權(quán)組平均法(UPGMA)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。3種序列比對(duì)結(jié)果顯示，Aeromonassp.T1與Aeromonassp.T2序列具有較高的相似度，分別為97.5%(Jotun Hein)、96%(ClustalV)、96.4%(ClustalW)；Aeromonassp.T1與Genebank登錄號(hào)為HM778461.1序列相似度最高，分別為97.1%(Jotun Hein)、93.8%(ClustalV)、94.5%(ClustalW)；Aeromonassp.T2與同樣與Genebank登錄號(hào)為HM778461.1序列相似度最高，分別為97.7%(Jotun Hein)、95.3%(ClustalV)、96.8%(ClustalW)。4種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致，可初步確立2株菌株的分類地位：Aeromonassp.T1、Aeromonassp.T2與登錄號(hào)為HM127065.1的菌株的聚為一類，親緣關(guān)系最近。

氣單胞菌(Aeromonas)；16S rDNA；分子鑒定

氣單胞菌屬(Aeromonas)曾與弧菌屬(Vibrio)、原細(xì)菌屬(Protobacterium)和鄰單胞菌屬(Plesiomonas)被歸入弧菌科(Vibrionaseae)[1]。隨著現(xiàn)代分子遺傳學(xué)的發(fā)展，以往被歸類為弧菌科的氣單胞菌屬劃為一個(gè)獨(dú)立的科，即氣單胞菌科。到目前為止該項(xiàng)包括：嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)、維隆氣單胞菌(Aeromonasveronii)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)、中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)、嗜礦泉?dú)鈫伟?Aeromonaseucrenophila)、簡(jiǎn)氏氣單胞菌(Aeromonasjandaei)、鰻魚氣單胞菌(Aeromonasichthiosmia)、舒氏氣單胞菌(Aermonasschubertii)、尺骨氣單胞菌(Aeromonastrota)、氣單胞菌群501、異常嗜糖氣單胞菌(Aeromonasallosaccharophila)和斑點(diǎn)氣單胞菌(Aeromonaspunctata)共14 個(gè)氣單胞菌表型種和16個(gè)基因種[1,2]。

細(xì)菌分類鑒定方法包括表型鑒定法和分子遺傳學(xué)鑒定法2大類，分成4個(gè)水平細(xì)菌形態(tài)和生理生化水平、細(xì)胞組分水平、蛋白質(zhì)水平和核酸水平。表型鑒定法是對(duì)前3個(gè)水平的鑒定，包括常規(guī)鑒定法、數(shù)值分類鑒定法和化學(xué)分類鑒定法[3]。分子遺傳學(xué)鑒定法是核酸水平的鑒定，對(duì)細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析，包括G + C含量測(cè)定、核酸雜交、PCR 技術(shù)、16S rRNA 和16～23S rRNA序列分析、全基因組測(cè)序等。其中16S rRNA/rDNA 序列分析技術(shù)是分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)，目前已被廣泛應(yīng)用于微生物的分類、鑒定以及微生物的群落研究，由于該技術(shù)具有方便、準(zhǔn)確、快捷等特點(diǎn)，在鑒定土壤樣品中的細(xì)菌[4]、動(dòng)物內(nèi)臟及腸道中的菌落[5]、野生菌株的歸屬[6]、致病菌的快速鑒定[7]等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

本研究對(duì)分離自患出血病鯽魚的腸道和腹水中的2株氣單胞菌屬細(xì)菌Aeromonassp.T1和Aeromonassp.T2進(jìn)行16S rDNA基因的序列進(jìn)行序列同源性和聚類分析，以鑒定其分類地位，為進(jìn)一步應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株

氣單胞菌菌株Aeromonassp.T1和Aeromonassp.T2分離自患病鯽魚(Carassiusauratusgibelio)。

1.1.2 主要試劑

溴化乙錠(EB)、dNTP(10mmol/L)、溴酚藍(lán)、Tris堿、EDTA等購(gòu)自Amresco公司；Taq酶購(gòu)自Fermentas公司；DNA Mark、DNA 提取試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司；瓊脂糖購(gòu)自Biowest公司；牛肉膏、胰蛋白胨、瓊脂粉、冰醋酸、NaCl等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)

4℃斜面保存的菌株涂布于平板，28℃培養(yǎng)24h，用生理鹽水洗下菌苔制成菌懸液。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取

按照DNA提取試劑盒的說(shuō)明書提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。

1.2.3 16S rDNA基因片段的擴(kuò)增

采用16S rDNA細(xì)菌通用引物：8f: 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’；1492r: 5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)按以下次序，將各成分在0.5ml無(wú)菌PCR管內(nèi)混合，總體積25μl：PCR buffer(10×，2.5μl)、MgCl2(25mmol/L，1.5μl)、dNTPs(2mmol/L，2.0μl)、上游和下游引物(10μmol/L，各0.5μl)、模板DNA(0.3～0.4μg)、Taq-DNA (1U/μl，0.5μl)，最后補(bǔ)加滅菌ddH2O至25μl。 短暫離心(8000r/min，10s)混勻，每管加入30μl液體石蠟油覆蓋于反應(yīng)混和液上，將樣品置于PCR合成儀中按以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃保溫8min。末輪循環(huán)后一直維持在4℃，擴(kuò)增產(chǎn)物置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠1mg/L)在5V/cm的電壓下電泳。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)照相，觀察到所需產(chǎn)物的擴(kuò)增帶后，送上海生工武漢測(cè)序部進(jìn)行產(chǎn)物純化和正反測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用ContigExpress軟件進(jìn)行序列拼接得到其16S rDNA基因全序列， BLAST相似序列，以MegAlign軟件比較這些序列的差異和相似度。用ClustalX軟件排列比對(duì)序列，用Mega4.0軟件分別進(jìn)行、鄰接法(N-J)、最小進(jìn)化法(ME)、最大簡(jiǎn)約法(MP)、非加權(quán)組平均法(UPGMA)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中自舉檢驗(yàn)1000個(gè)副本。

2 結(jié)果與分析

2.1PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

按照1.2.2的方法提取得到各菌株的總DNA，電泳檢測(cè)無(wú)拖尾現(xiàn)象,表明質(zhì)量較高(圖1)，可直接用于PCR反應(yīng)。以16S rDNA的通用引物(8f，1492r)，擴(kuò)增得到的片段大小為1500bp左右，符合預(yù)期大小，擴(kuò)增特異性較高(圖2)。

圖1 DNA電泳圖 圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2目的基因測(cè)序結(jié)果

以通用引物作為測(cè)序引物，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，所得測(cè)序峰圖中大多數(shù)堿基峰清晰，雜峰較少，測(cè)序起始后的前40個(gè)左右堿基峰型相對(duì)雜亂，通過(guò)ContigExpress軟件進(jìn)行雜峰修正和正反序列的拼接，得到2株氣單胞菌屬細(xì)菌的1500bp左右片段。Aeromonassp.T1和Aeromonassp.T2 DNA序列見表1。

2.3序列比對(duì)結(jié)果

以拼接后的各菌株16S rDNA序列在Genebank中進(jìn)行BLASTA比對(duì)，搜索同源較近的序列，從中挑選出4個(gè)序列： Uncultured bacterium clone aaa64h02 (DQ817645.1)、Uncultured bacterium clone SINI708 (HM127056.1)、Uncultured bacterium clone JFR0501_aaa05c04 (HM778461.1)和Uncultured bacterium clone JFR0501_aaa03e08 (HM778618.1)。Megalign軟件比較序列得到的同源性結(jié)果如圖3～圖5。3種序列比對(duì)結(jié)果顯示，Aeromonassp.T1與Aeromonassp.T2序列具有較高的同源性，分別為97.5%(Jotun Hein)、96%(ClustalV)、96.4%(ClustalW)；Aeromonassp.T1與Genebank登錄號(hào)為HM778461.1序列同源性最高，分別為97.1%(Jotun Hein)、93.8%(ClustalV)、94.5%(ClustalW)；Aeromonassp.T2同樣與Genebank登錄號(hào)為HM778461.1序列同源性最高，分別為97.7%(Jotun Hein)、95.3%(ClustalV)、96.8%(ClustalW)。

圖3 Jotun Hein法基因序列比較結(jié)果

圖4 ClustalV法基因序列比較結(jié)果

圖5 ClustalW法基因序列比較結(jié)果

圖6 N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 ME法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖8 MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖9 UPGMA法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

以登錄號(hào)為X16895.1的鰻弧菌(Vibroanguiuarum)16S rDNA序列作為屬外序列，采用Mega4.0軟件以4種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本相似(圖6～圖9)。初步確立兩株菌株的分類地位為，Aeromonassp.T1、Aeromonassp.T2與登錄號(hào)為HM127065.1的菌株的聚為一類，親緣關(guān)系最近。

3 討論

16S rDNA序列保守區(qū)和多變區(qū)間隔排列，選擇合適的區(qū)域作為分子標(biāo)記，可以用于區(qū)分不同的分類等級(jí)。以多少相似性程度作為各分類等級(jí)的劃分標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)根據(jù)特定的研究對(duì)象來(lái)確定[8]。本研究中菌株16S rDNA的擴(kuò)增、測(cè)序采用的是8f和1492r細(xì)菌通用引物，而其它菌株在擴(kuò)增和測(cè)序時(shí)所采用的引物可能不盡相同，造成相應(yīng)序列長(zhǎng)度的差異。本研究數(shù)據(jù)分析中采用的是原始序列長(zhǎng)度，未進(jìn)行序列的人工切除，可能影響到序列比對(duì)的結(jié)果，在比對(duì)的序列中同源性100%的2對(duì)序列較少。另外本研究采用3種方法對(duì)分離株與BLAST序列進(jìn)行了序列相似性的比對(duì)，結(jié)果分離株與其相似度最高的序列是一致的。而這3種序列排列方法有所不同，Jotun Hein法是根據(jù)已有的系統(tǒng)調(diào)整相關(guān)的序列進(jìn)行比對(duì)，而其他2種方法不需要這個(gè)假設(shè)，ClustalW較ClustalV更進(jìn)步，提供更準(zhǔn)確的高度分化序列比對(duì)。因此，在本研究中應(yīng)用Jotun Hein法得出的序列相似性較其他2種方法稍高。

對(duì)DNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析的3個(gè)主要步驟是比對(duì)、建立取代模型和進(jìn)化樹以及進(jìn)化樹評(píng)估。目前建樹方法主要有3類，分別是距離法(包括最小進(jìn)化法和鄰接法等)、最大簡(jiǎn)約法(maximum parsimon，MP)和最大似然法(maximum likelihood，ML)。距離建樹法考察數(shù)據(jù)組中所有序列的兩兩比對(duì)結(jié)果，通過(guò)序列兩兩之間的差異決定進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和樹枝長(zhǎng)度；最大簡(jiǎn)約法考察數(shù)據(jù)組中序列的多重比對(duì)結(jié)果，優(yōu)化出的進(jìn)化樹能夠利用最少的離散步驟去解釋多重比對(duì)中的堿基差異；最大似然法考察數(shù)據(jù)組中序列的多重比對(duì)結(jié)果，優(yōu)化出擁有一定拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和樹枝長(zhǎng)度的進(jìn)化樹，這個(gè)進(jìn)化樹能夠以最大的概率導(dǎo)致考察的多重比對(duì)結(jié)果。這3種建樹方法由于各自的局限性均可能導(dǎo)致系統(tǒng)誤差的產(chǎn)生[9]，為了盡量避免誤差的影響，本研究同時(shí)采用了3類方法，通過(guò)比較它們所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，來(lái)綜合分析系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。可見4種方法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致，本研究所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹是可信的，各分離菌株的最近親緣關(guān)系菌株也是可信的。

本研究中BLAST查找同源性較高的條序列均為不可培養(yǎng)細(xì)菌克隆的序列，不可培養(yǎng)微生物的概念是1982年Colwell 實(shí)驗(yàn)室提出的概念，他們發(fā)現(xiàn)將霍亂弧菌和大腸埃希菌(簡(jiǎn)稱大腸桿菌)轉(zhuǎn)到不含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的鹽水中，經(jīng)常長(zhǎng)時(shí)間的低溫保存，細(xì)菌會(huì)進(jìn)入一種數(shù)量不減、有代謝活力、但在正常試驗(yàn)室培養(yǎng)條件下不能生長(zhǎng)產(chǎn)生菌落的狀態(tài)，稱為活的但不能培養(yǎng)(viable but nonculturable，VBNC)狀態(tài)。其后對(duì)多種屬細(xì)菌進(jìn)行試驗(yàn)證明，這種不可培養(yǎng)狀態(tài)是普遍存在的。自然界中也廣泛存在著這種活的但不可培養(yǎng)微生物，在各種生境中僅有小部分的微生物可用實(shí)驗(yàn)室方法分離培養(yǎng)，而未被培養(yǎng)的種類卻代表了巨大的多樣性[10]。本研究中的2株氣單胞菌與GenBank中登錄號(hào)為HM127065.1的菌株的聚為一類，親緣關(guān)系最近。而HM127065.1的菌株為西藏湖泊中的1株不可培養(yǎng)細(xì)菌克隆(Uncultured bacterium clone SINI708)，由此可見，細(xì)菌未被培養(yǎng)的種類可在特定的環(huán)境中被分離培養(yǎng)。

[1]楊東霞，曲險(xiǎn)峰，楊暑伏.氣單胞菌分類及檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸藥雜志，2003，13(3)：247-249.

[2] 胡靜儀，王金良.氣單胞菌屬分類與鑒定方法[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2004，25(2)： 22-23.

[3] 杜昕波，趙 耘，李偉杰.菌種保藏中的細(xì)菌鑒定方法[J].中國(guó)獸藥雜志，2009，43(3)：50-53.

[4] 吳文龍，段淑蓉，李文均，等.3株抗灰霉病放線菌的分離和鑒定[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26 (3)：270-274.

[5] 蔣 燕，鮑寶龍，謝彩霞，等.16S rDNA文庫(kù)法分析草魚肝胰臟和膽汁細(xì)菌群落組成[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，19(4)：441-446.

[6] 張會(huì)敏，馮友軍.一株野生細(xì)菌的16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[J].生物信息學(xué)，2005，29(5)： 1-5.

[7] 鄭桂麗，翟俊輝，唐學(xué)璽，等.16S rDNA寡核苷酸芯片鑒定致病菌的初步研究[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2005，29(1)：13-18.

[8] Lee S K Y，Wang H Z，Law S H W，et al.Analysis of the 16S-23S rDNA intergenic spacers (IGSs)of marine vibrios for species-specific signature DNA sequences[J].Mairne Pollit Bullit，2002，44：412-420.

[9] Iguchi A，Ito H，Ueno M，et al.Molecular phylogeny of the deep-sea Buccinum species (Gastropoda:Buccinidae) around Japan：Inter-and intraspecific relationships inferred from mitochondrial 16S rRNA sequences[J].Science Direct，2007，44：1342-1345.

[10] 郭 瀟，雷曉凌.活的不可培養(yǎng)的細(xì)菌的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2010，30(3)：82-86.

10.3969/j.issn.1673-1409.2011.07.118

Q939

A

1673-1409(2011)07-0257-06

2011-07-01

長(zhǎng)江大學(xué)博士啟動(dòng)基金(801200010110)。

譚鳳霞，女，博士，講師，主要從事微生物學(xué)研究。