康潤敏，陳曉暉，曾 凱，徐昌文，周英順

（1.四川省畜牧科學研究院，四川 成都610066；2.四川大學動物疫病防控與食品安全四川省重點實驗室，四川 成都610064）

長途運輸作為一種應(yīng)激原常常會導(dǎo)致運送的豬只發(fā)生死亡和發(fā)病，Van der Meulen［1］等（2001）證明長途運輸?shù)膽?yīng)激能夠降低腸道內(nèi)pH值，使腸道的滲透性增加，運輸結(jié)束后腸道的滲透性達到最高峰。滲透性的增加導(dǎo)致腸道內(nèi)的細菌和內(nèi)毒素從腸道遷移至全身血液循環(huán)中，這可能能夠解釋運輸后疾病增加的原因［2－3］。2010年9月下旬，因豬場搬遷某集約化養(yǎng)豬場將豬只進行長途運輸，豬場搬遷后20日間陸續(xù)出現(xiàn)11頭種豬急性死亡。本次試驗通過對急性死亡種豬臨床癥狀觀察，并采集急性死亡豬的病料，對可疑引起豬死亡臨床癥狀和病理解剖變化的病原進行實驗室診斷，并且進行細菌分離，然后檢測分離出的細菌對18種常見藥物的敏感性試驗，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料

1.1 病料的采集 無菌采集急性死亡種豬的心、肝、脾、肺、腎、腹股溝淋巴結(jié)、腦等病料組織。

1.2 試劑 Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自上海英駿生物技術(shù)有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNAMarkerDL－2000，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；藥敏試紙，購自廣州市迪景微生物科技有限公司；小鼠，購自四川大學華西醫(yī)學院實驗動物中心。

1.3 引物 豬瘟病毒引物是根據(jù)報道的中國C株E2區(qū)基因設(shè)計合成一對豬瘟病毒（Classical swine fever virus）特異性的PCR引物，片度跨幅A/D抗原區(qū)，擴增片段為375bp；豬日本乙型腦炎病毒引物根據(jù)GenBank報道的豬日本乙型腦炎病毒E基因序列并參考文獻［4］設(shè)計，擴增片段為349bp；偽狂犬病病毒引物根據(jù)GenBank的偽狂犬病病毒gE基因并參考文獻［5］設(shè)計，擴增片段為370bp；豬繁殖與呼吸綜合征病毒按照JXA1株為參考設(shè)計部分NSP2基因為引物，經(jīng)典豬繁殖與呼吸綜合征病毒擴增片段為799bp，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒擴增片段為709bp；16SPCR引物參照文獻［6］，擴增片段為1 500bp，上述引物序列見表1，上述引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 各病毒引物序列

2 方法

2.1 臨床癥狀 觀察死亡種豬體表狀況，剖檢死亡豬只觀察病死豬心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)以及腦的病理變化。

2.2 病毒檢測 無菌采集死豬病料（肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等）剪碎，研磨后，加入滅菌的生理鹽水，制成10%的懸液，－80℃保存用于病毒提??；用酚氯仿方法提取病料中的DNA，按Trizol試劑使用說明書來提取樣品的總RNA；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將樣品的RNA直接進行反轉(zhuǎn)錄合成全長cDNA，將所提取的DNA和反轉(zhuǎn)錄的cDNA進行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer 5μL，上/下游引物（50pmol/μL）各1μL，10mmol/LdNTP 2μL，25 mmol/L MgCl22μL，TaqDNA 聚合酶（5U/μL）1μL，滅菌雙蒸水34μL，模板4μL。各病毒的擴增條件如下，豬瘟病病毒擴增條件：95℃5min；95℃1min，52℃1min，72℃1min，共35個循環(huán)，循環(huán)后72℃延伸10min；豬日本乙型腦炎病毒擴增條件：94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min，共30個循環(huán)，循環(huán)后72℃8min；偽狂犬病病毒擴增條件：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃1min，共30個循環(huán)，循環(huán)后72℃延伸10min；豬繁殖與呼吸綜合征病毒擴增條件：94℃3min；94℃40s，57℃45s，72℃5min，共29個循環(huán)，72℃10 min。

2.3 細菌分離 將無菌采集的死豬病料（心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等）分別接種于含10%兔血的營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個菌落進行革蘭染色鏡檢，然后挑取單個菌落接種于兔血的營養(yǎng)瓊脂平板上純化培養(yǎng)16h。

2.4 細菌致病性檢測 挑取純化的單菌落接種于10mL的血清肉湯中，將肉湯培養(yǎng)基放入37℃搖床中，振蕩培養(yǎng)12h，取培養(yǎng)液0.2mL注射入健康小鼠腹腔，16h后觀察小鼠的臨床表現(xiàn)和死亡情況，并將死亡小鼠進行細菌分離。

2.5 細菌鑒定 16SrRNA通用引物對所分離細菌進行鑒定，反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer 5μL，上/下游引物（50pmol/μL）各1μL，10mmol/L dNTP 2μL，25mmol/L MgCl22μL，TaqDNA 聚合酶（5U/μL）1μL，滅菌雙蒸水34μL，cDNA模板4μL；16SrRNA擴增條件：94℃預(yù)變性1min，然后94℃1min，50℃1min，72℃1min 30s，循環(huán)30周期，最后72℃延長5min，反應(yīng)結(jié)束后，16SrRNA產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進行電泳，陽性16SrRNA產(chǎn)物直接送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

2.6 藥敏試驗 挑取純化的細菌接種于10mL血清肉湯培養(yǎng)基中，將接有細菌的血清肉湯培養(yǎng)基放入37℃搖床中，振蕩培養(yǎng)12h，取培養(yǎng)液0.2mL均勻涂抹在普通培養(yǎng)基的平板中，再將藥敏紙片均勻的粘貼于培養(yǎng)基上，置入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察并測定抑菌圈直徑。判定標準美國臨床標準委員會（NCCLS）手冊2005版。

3 結(jié)果

3.1 臨床癥狀 長途運輸后20日內(nèi)，曾出現(xiàn)嚴重應(yīng)激反應(yīng)的成年種豬先后急性死亡11頭，臨床表現(xiàn)為高熱（40℃～41.5℃），白豬全身皮膚表面發(fā)紅，局部斑塊狀紅疹，黑豬皮膚表面呈凸起狀斑塊，呼吸加快，牙關(guān)緊閉，口吐白沫或者血沫。急性死亡后病理變化以皮膚紫癜，以及心臟外膜、肺臟、胃底部、胸前淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)嚴重出血等癥狀為主。

3.2 病毒檢測 RT－PCR結(jié)果顯示，死豬的病料中并未感染豬瘟病毒，經(jīng)典豬繁殖與呼吸綜合征病毒，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒，豬日本乙型腦炎病毒；PCR結(jié)果顯示，死豬的病料中未感染偽狂犬病病毒。

3.3 細菌分離 病料接種血瓊脂平板中培養(yǎng)24h后，心、肝、脾、肺、腎接種區(qū)域均出現(xiàn)針尖大小菌落，培養(yǎng)48h后菌落呈現(xiàn)無色透明狀；挑取單個菌落接種于普通營養(yǎng)瓊脂中24h后見極小菌落，培養(yǎng)48h后見菌落長有針尖大小、菌落呈圓形、平滑、透明；經(jīng)革蘭染色后觀察，各組織分離到的細菌均為革蘭陽性桿菌、無鞭毛、無莢膜、形態(tài)極小、兩端鈍圓、部分細菌可見彎曲狀，并且可見以單個和鏈狀存在。

3.4 細菌致病性 注射小鼠后，小鼠于24h發(fā)生死亡，將死亡小鼠進行剖檢，取死亡小鼠的心、肝、脾、肺、腎進行細菌分離，結(jié)果顯示，從死亡小鼠器官中分離的細菌菌落大小似針尖狀，革蘭染色為陽性桿菌，部分可見彎曲狀。

3.5 細菌檢測 16SrRNA的產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖1。使用NCBI中的Blast軟件對測序結(jié)果進行在線比對，結(jié)果表明，分離菌株與豬紅斑丹毒絲菌ATCC19414的同源性高達99%，結(jié)果顯示，病豬是由于感染了豬紅斑丹毒絲菌而導(dǎo)致死亡。

圖1 16SrRNA產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3.6 藥敏試驗 使用18種常見的抗菌藥物對從病料中分離的豬紅斑丹毒絲菌進行敏感性試驗，結(jié)果顯示，阿莫西林，氨芐西林，替卡西林，紅霉素，頭孢噻吩，恩諾沙星，頭孢唑啉，環(huán)丙沙星，頭孢噻吩對分離的丹毒桿菌的抑菌效果好，而分離的丹毒桿菌對阿米卡星，慶大霉素，新霉素，兩性霉素具有耐藥性。

4 治療

本次通過診斷結(jié)果進行臨床處理，全場進行丹巴二連苗（含豬丹毒桿菌G4T10弱毒株和豬多殺巴氏桿菌E0630弱毒株）豬緊急免疫，并且對出現(xiàn)臨床癥狀的豬只使用藥敏試驗中高度敏感的恩諾沙星和阿莫西林，通過治療和緊急免疫，豬只開始進食，病情逐漸好轉(zhuǎn)，通過1周治療后，病情得到很好的控制。

5 討論

應(yīng)激反應(yīng)是指機體突然受到強烈有害刺激時，通過下丘腦引起血中促腎上腺皮質(zhì)激素濃度迅速升高，糖皮質(zhì)激素大量分泌導(dǎo)致畜禽一系列機體和代謝的改變。長途運輸往往是引起應(yīng)激反應(yīng)的一個重要原因，而應(yīng)激會導(dǎo)致疾病增加，Berends B R（1996）［7］試驗證明運輸導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)有可能是導(dǎo)致豬感染沙門菌的主要因素，本試驗所研究的種豬急性死亡的病例也是由于種豬經(jīng)過長途運輸后感染豬紅斑丹毒絲菌而導(dǎo)致的。豬丹毒是由豬紅斑丹毒絲菌又稱為丹毒桿菌引起的一種急性傳染病，廣泛分布于全國各地?？股厥侵委熂毦膊〉闹饕幬?，由于抗生素的濫用導(dǎo)致細菌對大多數(shù)抗生素具有耐藥性，本研究通過藥敏試驗證明豬紅斑丹毒絲菌對阿米卡新，慶大霉素，新霉素和兩性霉素具有耐藥性，其結(jié)果與雷燕［8］結(jié)果相似，但是本研究中豬紅斑丹毒絲菌對阿莫西林敏感，其結(jié)果與雷燕［8］結(jié)果相反，可能由于豬紅斑丹毒絲菌的菌株不同或者本試驗中研究豬紅斑丹毒絲菌，并且本研究中的豬場在平時疾病治療過程中并未大量以及時常使用阿莫西林，這也許是本研究分離的豬紅斑丹毒絲菌對阿莫西林敏感，而雷燕［8］所分離的豬紅斑丹毒絲菌對阿莫西林的不敏感的主要原因。

［1］ van der Meulen J，de Graaf G J，Nabuurs M J A ，etal.Effect of transportation stress on intra－mucosal pH and intestinal permeability［C］.8Symposium on Digestive Physiology in Pigs，CAB International，2001：329－331.

［2］ Zucker B A，Kruger M .Auswirkungen von transportbelastugen auf den endotoxingelhalt im blut von schlac－h(huán)tsch－weinen［J］.Berl Munchen Tierarztl Wochenschr，1998，111：208－210.

［3］ Berg R D.Bacterial translocation form the gastrointestinal tract［J］.Adv Exp Med Biol，1999，473：11－30.

［4］ 呂曉麗，崔保安，陳紅英，等.復(fù)合RT－PCR檢測豬乙腦病毒和豬流感病毒方法的建立［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2008，29（4）：79－81.

［5］ 韓勇，李文剛，項朝榮，等.豬偽狂犬病病毒的分離和鑒定［J］.動物醫(yī)學進展，2007，28（3）：43－45.

［6］ 龍雯，陳存社.16SrRNA測序在細菌鑒定中的應(yīng)用［J］.北京工商大學學報：自然科學版，2006，24（5）：10－12.

［7］ Berends B R，Urlings H A P，Snijders J M A，etal.Identification and quantification of risk factors in ani－mal management and transport regarding Salmonella spp in pigs［J］.International Journal of Food Microbiology，1996，3（12）：37－53.

［8］ 雷 燕，顏其貴，韓國全，等.一起育肥豬急性死亡病例的診治［J］.豬業(yè)科學，2010，2：76－78.