李飛 謝立群 冀潤(rùn)利 周靜 鄭艷敏 劉彩菊 段澤新

·論著·

氧化苦參堿對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

李飛 謝立群 冀潤(rùn)利 周靜 鄭艷敏 劉彩菊 段澤新

目的探討氧化苦參堿對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990體外遷移及侵襲能力的影響及其作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人胰腺癌SW1990細(xì)胞株，用氧化苦參堿處理SW1990細(xì)胞后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；通過(guò)細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的黏附、遷移及侵襲能力； RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) mRNA的表達(dá)； ELISA法檢測(cè)細(xì)胞VEGF蛋白的含量。結(jié)果氧化苦參堿呈劑量和時(shí)間依賴性抑制SW1990細(xì)胞的增殖。2 mg/ml氧化苦參堿處理SW1990細(xì)胞1 h后，細(xì)胞的體外黏附抑制率為(35.23±8.56)%；處理24 h后，細(xì)胞的過(guò)河時(shí)間為(65.46±4.25)h，較對(duì)照組的(34.50±4.12)h顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；穿膜細(xì)胞數(shù)為(91.9±9.6)個(gè)，較對(duì)照組的(144.2±17.2)個(gè)顯著減少(P<0．05)；細(xì)胞VEGF、MMP-2 mRNA的表達(dá)及VEGF蛋白的分泌量均顯著下調(diào)[0.515±0.063比0.817±0.054，0.343±0.072比0.650±0.068，(265.50±5.45)pg/ml比(441.06±16.70)pg/ml，P值均<0．05]。結(jié)論氧化苦參堿可能通過(guò)抑制MMP-2和VEGF表達(dá)進(jìn)而抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖、黏附、遷移及侵襲能力。

胰腺腫瘤； 氧化苦參堿； 腫瘤侵潤(rùn)； 腫瘤轉(zhuǎn)移

80%的胰腺癌患者在臨床確診時(shí)已發(fā)現(xiàn)有局部侵犯及血行、淋巴轉(zhuǎn)移， 5年生存率低于5%[1]。氧化苦參堿(oxymatrine,OM)是從中藥苦參中提取的一種生物堿，具有抗腫瘤、抗炎、抗過(guò)敏、抗肝纖維化、免疫及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)等作用[2-3]。其抗腫瘤活性主要為抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)凋亡，以及誘導(dǎo)分化等[4-6]。本實(shí)驗(yàn)觀察氧化苦參堿對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990細(xì)胞增殖、黏附、遷移及侵襲力的影響，探討氧化苦參堿的抗腫瘤作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、MTT法檢測(cè)SW1990細(xì)胞增殖

人胰腺癌細(xì)胞株SW1990由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所提供，常規(guī)培養(yǎng)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后改無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，然后加入終濃度分別為1、2、4、8、16 mg/ml的氧化苦參堿(江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20057480)繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，以不加氧化苦參堿為對(duì)照組，單純培養(yǎng)液為空白組。每孔加入5 mg/ml MTT溶液(Sigma公司)20 μl后再培養(yǎng)4 h，1500 r/min離心10 min，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-Rad550型)上測(cè)490 nm波長(zhǎng)吸光度(A490)值。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(IR)=(對(duì)照組A490值-處理組A490值)/(對(duì)照組A490值-空白組A490值)×100%。

二、細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

96孔板每孔鋪Matrigel 30 μg，置37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜待用。每孔加入2500個(gè)用1、2、4 mg/ml氧化苦參堿處理24 h的SW1990細(xì)胞(50 μl)，以不加氧化苦參堿作為對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。PBS洗去未黏附細(xì)胞，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl后再培養(yǎng)4 h。棄去MTT，加入150 μl DMSO，測(cè)A490值。細(xì)胞黏附抑制率=(對(duì)照組A490值-處理組A490值)/對(duì)照組A490值×100%。

三、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1990細(xì)胞，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞量加入24孔板，待細(xì)胞培養(yǎng)至基本鋪滿后棄培養(yǎng)液，用100 μl Tip吸頭在孔中劃一直線。加入終濃度分別為1、2、4 mg/ml的氧化苦參堿，以不加氧化苦參堿作為對(duì)照組。培養(yǎng)24 h后每2 h觀察1次，直至劃痕被細(xì)胞填滿。觀察過(guò)河所需時(shí)間。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

四、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1990細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液孵育12 h，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×105/ml個(gè)。Transwell趨化小室(孔徑6.5 mm，Millipore公司)的上室加入200 μl單細(xì)胞懸液及200 μl終濃度分別為1、2、4 mg/ml的氧化苦參堿，以不加氧化苦參堿作為對(duì)照組；下室加600 μl條件培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出濾膜，刮凈上室細(xì)胞，下層黏附的穿膜細(xì)胞用95%乙醇固定10 min，蘇木精染色15 min，200倍光鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。每組3個(gè)趨化小室，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

將50 μg Matrigel膠用4℃ DMEM培養(yǎng)液1∶4稀釋，分3次涂于Transwell小室微孔濾膜上，每次間隔10 min。包被后用紫外線照射2 h殺菌，使用前上室加少量無(wú)血清培養(yǎng)基室溫水化2 h。重復(fù)上述細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，共3次。

五、RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞VEGF、MMP-2 mRNA表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×105/ml個(gè)接種于25 ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24 h后用無(wú)血清H-DMEM培養(yǎng)12 h，再用1、2、4 mg/ml氧化苦參堿處理細(xì)胞24 h，對(duì)照組不加氧化苦參堿。收集細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，鑒定其純度及完整性。應(yīng)用Omiga2.0設(shè)計(jì)引物，VEGF上游引物5′-CTACCTCCACCATGCCAAGT-3′，下游引物5′-TCTCTCCTATGTGCTGGCCT-3′，產(chǎn)物311 bp；MMP-2上游引物5′-CAGGCTCTT-CTCCTTTCACAAC-3′，下游引物5′-AAGCCACGGCTT-GGTTTTCCTC-3′，產(chǎn)物398 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-TGTTTGAGACCTTCAACACCC-3′，下游引物5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′，產(chǎn)物540 bp。引物由大連寶生物工程有限公司合成。逆轉(zhuǎn)錄條件：30℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min；PCR反應(yīng)條件： 94℃ 1 min，61℃ 45 s(VEGF)或55℃ 1 min (MMP-2)或58℃ 30 s(β-actin)，72℃ 1 min， 30個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠自動(dòng)成像2000系統(tǒng)掃描，以目的條帶與β-actin條帶的灰度值比表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。

六、ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF蛋白含量

取上述各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測(cè)VEGF蛋白含量。ELISA試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司，按說(shuō)明書(shū)操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算VEGF含量。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、氧化苦參堿對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響

氧化苦參堿呈濃度-時(shí)間性抑制細(xì)胞增殖(圖1)。16 mg/ml氧化苦參堿處理細(xì)胞24 h的增殖抑制率高達(dá)82.9%，但1、2、4 mg/ml氧化苦參堿對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率均<10%，故取這三種濃度進(jìn)行其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度氧化苦參堿對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響

二、氧化苦參堿對(duì)SW1990細(xì)胞黏附的影響

對(duì)照組A490值為1.10±0.16，1、2、4 mg/ml氧化苦參堿組A490值分別為0.88±0.12、0.71±0.20和0.59±0.18，均較對(duì)照組顯著降低(P<0．05)。1、2、4 mg/ml氧化苦參堿組的黏附抑制率分別為(20.16±4.24)%、(35.23±8.56)%和(46．83±7.26)%，呈明顯量效關(guān)系。

三、氧化苦參堿對(duì)SW1990細(xì)胞遷移的影響

對(duì)照組過(guò)河時(shí)間為(34.50±4.12)h，1、2、4 mg/ml氧化苦參堿組過(guò)河時(shí)間分別為(48.80±3.56)、(65.46±4.25)和(70.54±3.53)h，均較對(duì)照組顯著延長(zhǎng)(P<0．05，圖2)，且隨濃度增加而延長(zhǎng)。

四、氧化苦參堿對(duì)SW1990細(xì)胞侵襲力的影響

氧化苦參堿組細(xì)胞穿膜數(shù)呈濃度依賴性下降。對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為(144.2±17.2)個(gè)，1、2、4 mg/ml氧化苦參堿組分別為(117.1±13.6)、(91.9±9.6)和(77.4±8.4)個(gè)，均較對(duì)照組顯著減少(P<0．05)。應(yīng)用Matrigen包被后，對(duì)照組及1、2、4 mg/ml氧化苦參堿組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(102.4±11.2)、(84.2±9.3)、(69.1±8.8)和(57.9±6.1)個(gè)，氧化苦參堿組亦均較對(duì)照組顯著減少(圖3)，且呈濃度依賴性。

圖2對(duì)照組(a)及1(b)、2(c)、4(d)mg/ml氧化苦參堿組的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(36 h ×100)

圖3對(duì)照組(a)及1(b)、2(c)、4(d)mg/ml氧化苦參堿組的細(xì)胞穿膜數(shù)( ×100)

五、氧化苦參堿對(duì)SW1990細(xì)胞VEGF、MMP-2 mRNA表達(dá)及VEGF蛋白分泌的影響

對(duì)照組及1、2、4 mg/ml氧化苦參堿組細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)量分別為0.817±0.054、0.612±0.088、0.515±0.063和0.322±0.025；MMP-2 mRNA表達(dá)量分別為0.650±0.068、0.492±0.052、0.343±0.072和0.236±0.078，均較對(duì)照組顯著降低(P<0．05，圖4) ，且呈濃度依賴性。

對(duì)照組及1、2、4 mg/ml氧化苦參堿組細(xì)胞VEGF蛋白分泌量分別為(441.06±16.70)、(356.09±16.52)、(265.50±5.45)和(158.11±17.69)pg/ml，氧化苦參堿各組均顯著低于對(duì)照組(P值均<0．05)，且呈濃度依賴性 。

討 論

從分子水平看，惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的過(guò)程首先是癌細(xì)胞與癌細(xì)胞間的黏附松解，然后癌細(xì)胞通過(guò)溶解蛋白侵入周圍的細(xì)胞外基質(zhì)，再進(jìn)入血管及淋巴管。在血液(淋巴)循環(huán)中，腫瘤細(xì)胞逃脫機(jī)體的免疫防御機(jī)制，黏附在轉(zhuǎn)移器官血管床的血管內(nèi)皮上，繼而脫離其血管系統(tǒng)，侵入靶器官，從此開(kāi)始增殖，并形成新生血管。因此黏附是癌細(xì)胞侵襲的起始步驟，隨后經(jīng)癌細(xì)胞的遷移、侵襲等方式實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的結(jié)果。

1、2、3：1、2、4 mg/ml氧化苦參堿組；4：對(duì)照組

圖4各組SW1990細(xì)胞VEGF(上)、MMP-2(下) mRNA的表達(dá)

本體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氧化苦參堿呈濃度-時(shí)間依賴性抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990的增殖、黏附及遷移，與文獻(xiàn)報(bào)道的氧化苦參堿對(duì)其他癌細(xì)胞的作用相似。

在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)的降解和促血管生成因子誘導(dǎo)的新生血管形成起著重要作用[7-8]?；|(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是人體內(nèi)降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，特別是MMP-2和MMP-9在腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移灶的形成過(guò)程中起重要作用。研究表明，胰腺癌MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白的表達(dá)增加[9]，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)[10]。

VEGF是作用最強(qiáng)、特異性最高的促血管生長(zhǎng)因子之一，在腫瘤等病理情況下表達(dá)可異常增加，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。Itakura等[11]報(bào)道，胰腺癌組織VEGF mRNA含量是正常胰腺組織的5倍以上，75例胰腺癌患者中64例VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性，VEGF表達(dá)與微血管密度水平、腫瘤大小、局部浸潤(rùn)相關(guān)，但與生存率無(wú)關(guān)。研究還表明，胰腺癌MMP-2、VEGF

的表達(dá)與胰腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胰腺癌SW1990細(xì)胞有MMP-2、VEGF mRNA的表達(dá)，經(jīng)氧化苦參堿處理后，SW1990細(xì)胞MMP-2、VEGF mRNA表達(dá)量呈濃度依賴性下降，VEGF蛋白含量呈濃度依賴性減少。表明氧化苦參堿可能通過(guò)下調(diào)MMP-2和VEGF的表達(dá)抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

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2010-10-18)

(本文編輯：呂芳萍)

InfluenceofoxymatrineonmetastaticandinvasiveabilityofhumanpancreaticcancercelllineSW1990

LIFei，XIELi-qun，JIRun-li，ZHOUJing，ZHENGYan-min，LIUCai-ju，DUANZe-xin.

FirstDepartmentofInternalMedicine,XinjiangProductionandConstructionCorpHospitalofChinesepeople′sArmedPoliceForce,Urumqi830063,China

Correspondingauthor:XIELi-qun,Email:xieliqun66@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of oxymatrine on invasion and metastasis of human pancreatic cancer line SW1990 in vitro.MethodsHuman pancreatic cancer cell line SW1990 was cultured in vitro. Oxymatrine was added into the culture media of SWl990 cells. Then MTT assay was used to determine the effect on proliferation. The adhesive capability, the mobile ability and invasive ability of SWl990 cells were detected by the adhesion assay, the crossing-river test, the transwell migration assay and the matrigel invasion method, respectively. RT-PCR was used to detect the mRNA expression of MMP-2 and VEGF. ELISA method was used to detect the protein levels of the VEGF.ResultsThe growth of SWl990 cells was inhibited by oxymatrine in a dose and time-dependent manner. After 2 mg/ml of oxymatrine treatment for SW1990 cells for 1 h, the adhesive capability inhibitory rate was (35.23±8.56) %; 24 h later, crossing-river time was (65.46±4.25) h, which was significantly longer than that in control group [(34.50±4.12) h,P<0.05)], the number of penetrating cells was 91.9±9.6, which was significantly lower than that in control group (144.2±17.2,P<0.05). The mRNA expression of MMP-2 and VEGF, expression of protein of VEGF in SW1990 cells was significantly down-regulated [0.515±0.063vs. 0.817±0.054, 0.343±0.072vs. 0.650±0.068; (265.50±5.45) pg/mlvs. (441.06±16.70) pg/ml,P<0.05].ConclusionsOxymoron can inhibit the invasion and metastasis ability of pancreatic cancer line SW1990 in vitro, and the mechanism is possibly related to the down-regulation of MMP-2 and VEGF expression．

Pancreatic neoplasms； Oxymatrine； Neoplasm invasiveness； Neoplasm metastasis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.008

青島市科技基金項(xiàng)目(2008-wszo1003)

830063 烏魯木齊，新疆武警兵團(tuán)指揮部醫(yī)院內(nèi)一科(李飛)；武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(謝立群、冀潤(rùn)利、周靜、鄭艷敏、劉彩菊、段澤新)

謝立群，Email:xieliqun66@hotmail.com