柏志全, 李春英, 李 媛, 馬文波, 朱林燕, 葉文才, 張冬梅, 王立偉△, 陳麗新△

(暨南大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院生理系，2醫(yī)學(xué)院藥理系，3藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632)

·論著·

氯通道在華蟾酥毒基誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡中起重要作用*

柏志全1 ▲, 李春英1 ▲, 李 媛2, 馬文波1, 朱林燕2, 葉文才3, 張冬梅3, 王立偉1△, 陳麗新2△

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院生理系，2醫(yī)學(xué)院藥理系，3藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632)

目的： 研究氯離子通道在華蟾酥毒基(CBG)誘導(dǎo)低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞凋亡和凋亡性容積減小中的作用。方法實(shí)驗(yàn)設(shè)立空白對照組、CBG高、中、低劑量組及CBG與氯通道阻斷劑NPPB 聯(lián)合作用組。Hoechst 33342染色檢測細(xì)胞的凋亡率，活細(xì)胞圖像分析法檢測細(xì)胞容積變化，全細(xì)胞膜片鉗法記錄氯電流。結(jié)果(1)CBG濃度依賴性誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，高劑量CBG(8 μmol/L)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率為43.2％；(2)CBG可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡性容積減小，在CBG作用早期(50 min),細(xì)胞容積減小約9.9％。(3)CBG可激活氯通道，產(chǎn)生一個(gè)無明顯外向優(yōu)勢的氯電流。(4)氯通道阻斷劑NPPB可抑制CBG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、凋亡性細(xì)胞容積減小和氯電流。NPPB對CBG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和凋亡性容積減小的抑制率分別達(dá)80.1％和74.8％。結(jié)論以上結(jié)果提示CBG可能通過激活氯通道而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，氯通道的激活可能在CBG抗腫瘤機(jī)制中起重要作用。

華蟾酥毒基； 凋亡； 氯通道； 凋亡性細(xì)胞容積減小

蟾酥是一種名貴的中藥，其含有多種化學(xué)成分，具有抗腫瘤、強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、升壓等多種藥理活性。蟾酥對多種惡性腫瘤，如肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、白血病等，均有較好療效，對癌性疼痛亦有一定緩解作用，并可用于防治惡性腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1,2]。文獻(xiàn)報(bào)道，蟾酥中含量較高、藥理活性較強(qiáng)的蟾蜍內(nèi)酯類成分單體-華蟾酥毒基 (又稱華蟾毒精，cinobufagin，CBG) 對人肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和白血病等人體腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡都有抑制作用[1-3]，但其作用機(jī)制目前尚不明確。我們前文報(bào)道化療藥物順鉑抑癌作用機(jī)制之一是激活氯通道，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。本研究對華蟾酥毒基進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究，觀察其對鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響，研究其抗癌機(jī)制，探討氯離子通道在華蟾酥毒基抗腫瘤中的作用。

材 料 和 方 法

1腫瘤細(xì)胞株

低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640生長液中，置于37 ℃、飽和濕度、5％CO2孵箱培養(yǎng)，按常規(guī)方法傳代。

2藥品及試劑

氯通道阻斷劑5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoate (NPPB)為Sigma產(chǎn)品，NPPB用DMSO配制成100 mmol/L儲存液，使用終濃度為 100 μmol/L，DMSO最高終濃度為0.2％。Hoechst 33342/PI熒光染料購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。華蟾酥毒基(純度為95％)由暨南大學(xué)藥學(xué)院提供，用DMSO配制成1 mmol/L儲存液，置于4 ℃保存，臨用前用等滲灌流液稀釋到終濃度。等滲灌流液滲透壓為300 mOsmol /L，成分包括(mmol/L)：70 NaCl、0.5 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES 和140 D-甘露醇。用冰點(diǎn)滲透壓計(jì)(Osmomat 030,Gonotec)檢測滲透壓。灌流液pH值用Tris液調(diào)到7.4。

3細(xì)胞容積測量

將細(xì)胞懸液滴在小玻片上孵育1 h使其貼壁。實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞玻片安放在特制浴槽中。在倒置相差顯微鏡(IX71,Olympus)下選擇固定視野連續(xù)拍攝細(xì)胞圖像。用數(shù)字式攝像機(jī) (Retiga 4000R,QImaging) 連接相差顯微鏡與計(jì)算機(jī)，用Scion Image 圖像分析軟件(Scion Corporation)控制拍攝，每隔60s拍攝細(xì)胞圖像1幅，分析和測量細(xì)胞體積。細(xì)胞容積經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞容積(standardization cell volume，Vst)按Vst=(Vt/Vo)×100 公式計(jì)算，其中Vt是實(shí)時(shí)測得的細(xì)胞容積，Vo是同一細(xì)胞在等滲條件下的平均容積。實(shí)驗(yàn)設(shè)立空白對照組、華蟾酥毒基組 (8 μmol/L)、華蟾酥毒基(8 μmol/L)與氯通道阻斷劑NPPB(100 μmol/L)聯(lián)合作用組，實(shí)驗(yàn)時(shí)先用等滲液灌流5 min，然后分別給予華蟾酥毒基或華蟾酥毒基與NPPB灌流50min,空白對照組不給任何處理。所有實(shí)驗(yàn)在室溫(20-24 ℃)下進(jìn)行，重復(fù)3 次。

4Hoechst33342染色檢測細(xì)胞凋亡

實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、低劑量華蟾酥毒基組(0.1 μmol/L)、中劑量華蟾酥毒基組(4 μmol/L)、高劑量華蟾酥毒基組(8 μmol/L)、NPPB 組(100 μmol/L)、NPPB(100 μmol/L)與華蟾酥毒基(8 μmol/L)聯(lián)合作用組。24孔板培養(yǎng)， 1.1×105cells/well，藥物作用48 h后丟棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，每次3 min，每孔加入Hoechst 33342 10 μL和1 mL PBS混勻液，3 7℃孵育10-15 min。PBS洗滌1次。各孔加入1 mL的Buffer A工作液,室溫避光放置15 min。在倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，辨認(rèn)凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見濃染致密的顆粒狀亮藍(lán)色熒光者為凋亡細(xì)胞，呈彌散均勻的淡藍(lán)色熒光者為活細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并重復(fù)3 次。

5膜片嵌全細(xì)胞法記錄氯電流

用EPC-7膜片鉗放大器(Heka,Lambrecht/Pfalz)記錄單個(gè)鼻咽癌CNE/2Z的全細(xì)胞電流。使用外徑為1.5 mm、內(nèi)徑為0.86 mm的硼硅酸鹽毛細(xì)玻璃管，在微電極拉制器(PB-7)上分兩步拉制微電極。微電極尖端的電阻5-10 MΩ。電流和電壓信號用CED1401(CED，Cambridge)數(shù)字化(采樣頻率3 kHz),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用EPC(CED,Cambridge)軟件分析。電壓鉗制模式：細(xì)胞被鉗制在0 mV,以0 mV、±40 mV、±80 mV順序不斷反復(fù)循環(huán)，每個(gè)鉗制脈沖波寬200 ms，間隔4 s。細(xì)胞玻片安置在灌流槽中，實(shí)驗(yàn)在室溫(20-24 ℃)下進(jìn)行。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1華蟾酥毒基誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡

在熒光顯微鏡下可見，正常對照組的細(xì)胞狀態(tài)良好，少見凋亡和壞死細(xì)胞,熒光染料Hoechst 33342可以少許進(jìn)入正常細(xì)胞，正常細(xì)胞核Hoechst33342著色的形態(tài)呈圓形，染色質(zhì)分布均勻，染上淡藍(lán)色，而在華蟾酥毒基(8 μmol/L)作用下，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為進(jìn)入細(xì)胞的Hoechst 33342增多，熒光強(qiáng)度較高,部分細(xì)胞的核由于濃集而呈亮藍(lán)色，有明顯的凋亡小體出現(xiàn)，核染色質(zhì)凝集及邊聚化，部分核染色體碎片狀，核呈固縮狀或圓珠狀，見圖1。進(jìn)一步分析顯示，華蟾酥毒基濃度依賴性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，華蟾酥毒基低、中、高劑量組作用48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為(1.9±2.5)％、(27.9±2.5)％和(43.2±3.3)％。

Figure 1.Inhibition of cinobufagin-induced apoptosis by the chloride channel blocker NPPB (Hoechst 33342 fluorescent staining,×280).CBG: 8 μmol/L cinobufagin; CBG+NPPB: 8 μmol cinobufagin + 100 μmol/L NPPB.

2氯通道阻斷劑抑制華蟾酥毒基誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

在氯通道阻斷劑NPPB(100 μmol/L)的單獨(dú)作用下，細(xì)胞狀態(tài)較好，細(xì)胞中的熒光較弱，染色質(zhì)分布均勻，少見凋亡和壞死細(xì)胞。在加入華蟾酥毒基(8 μmol/L)的同時(shí)，聯(lián)合應(yīng)用氯通道阻斷劑NPPB(100 μmol/L)，結(jié)果顯示NPPB顯著抑制華蟾酥毒基誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡小體較之單純?nèi)A蟾酥毒基組少，熒光強(qiáng)度也較弱,見圖1，凋亡率從華蟾酥毒基組(43.2±3.3)％下降到(8.6±2.9)％，Plt;0.01，抑制率為80.1％。

3華蟾酥毒基誘導(dǎo)的凋亡性細(xì)胞容積減小

當(dāng)細(xì)胞處于等滲液中，連續(xù)灌流55 min細(xì)胞容積和細(xì)胞形態(tài)基本穩(wěn)定不變。而在細(xì)胞外灌流華蟾酥毒基后，細(xì)胞體積逐漸縮小，皺縮，部分細(xì)胞由圓形變?yōu)椴灰?guī)則狀。圖2顯示了等滲液對照組和8 μmol/L華蟾酥毒基組細(xì)胞0、30、50 min時(shí)的細(xì)胞圖像。圖像分析結(jié)果表明，細(xì)胞受到華蟾酥毒基刺激50 min后，可檢測到細(xì)胞容積縮小到加藥前等滲對照值的(90.1±0.9)％。

4氯通道阻斷劑抑制華蟾酥毒基誘導(dǎo)的凋亡性細(xì)胞容積減小

細(xì)胞外灌流氯通道阻斷劑NPPB時(shí)，明顯抑制華蟾酥毒基誘導(dǎo)的細(xì)胞容積減小，圖3顯示了對照組和藥物作用前后55 min內(nèi)細(xì)胞容積變化的連續(xù)過程。在華蟾酥毒基作用50 min時(shí)，細(xì)胞容積縮小至(90.1±0.9)％,Plt;0.01。華蟾酥毒基和NPPB聯(lián)合作用50 min時(shí)細(xì)胞容積僅減小至(97.5±0.7)％，與華蟾酥毒基組相比差異顯著(Plt;0.01)。氯通道阻斷劑NPPB對華蟾酥毒基誘導(dǎo)的凋亡性細(xì)胞容積縮小的抑制率達(dá)(74.8±4.5)％，顯著抑制華蟾酥毒基誘導(dǎo)的凋亡性細(xì)胞容積減小，見圖3。本結(jié)果提示華蟾酥毒基可能通過激活細(xì)胞氯通道而誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞容積減小。

Figure 2.Cell images taken during the process of apoptotic volume decrease induced by cinobufagin.ISO: isotonic solution; CBG: 8 μmol/L cinobufagin.

Figure 3.Inhibition of cinobufagin-induced apoptotic volume decrease by the chloride channel blocker NPPB.CBG: 8 μmol/L cinobufagin; NPPB+CBG: 100 μmol/L NPPB +8 μmol/L cinobufagin±sE.n=6

5華蟾酥毒基可以激活CNE/2Z細(xì)胞上的氯通道

當(dāng)細(xì)胞處于等滲液中，可以記錄一個(gè)穩(wěn)定且較小的氯電流,見圖4A，當(dāng)膜電位分別鉗制于-80 mV和80 mV時(shí)，細(xì)胞平均電流密度分別為(-3.2±0.3)pA/pF和(3.5±0.3)pA/pF。用含5 μmol/L華蟾酥毒基的等滲液灌流細(xì)胞可以激活氯電流，細(xì)胞平均電流分別增大至(-71.1±7.7)pA/pF(鉗制電壓：-80 mV)和(66.9±6.2)pA/pF(鉗制電壓：80 mV)(Plt;0.01)。結(jié)果顯示，華蟾酥毒基激活的氯電流無明顯的外向或內(nèi)向優(yōu)勢,見圖4B。細(xì)胞外灌流氯通道阻斷劑NPPB(100 μmol/L)可明顯抑制華蟾酥毒基所激活的氯電流，見圖4C。圖4D和4E分別顯示了華蟾酥毒基激活氯電流和NPPB抑制該電流的全過程以及不同處理時(shí)的電流-電壓關(guān)系。

Figure 4.Cinobufagin-induced chloride currents.CBG: 5 μmol/L cinobufagin; CBG+NPPB: 5 μmol/L cinobufagin + 100 μmol/L NPPB.**Plt;0.01 vs ISO+CBG±sE.n=6.A: control; B: cinobufagin; C: cinobufagin+NPPB; D: the time course of inhibition of cinobufagin challenge-induced chloride currents by NPPB; E: current-voltage relationship.ISO: isotonic solution.

討 論

用抗癌藥進(jìn)行化療在腫瘤的綜合治療中占有極其重要的地位。抗癌藥可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞增殖或/和誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡等不同環(huán)節(jié)而起抗癌作用。然而大多數(shù)實(shí)體瘤的治療目前仍未能達(dá)到滿意的效果。發(fā)現(xiàn)抗癌藥物作用新靶點(diǎn)，從天然產(chǎn)物中尋找新的抗癌藥物是藥物研發(fā)工作的重點(diǎn)之一。

蟾酥為我國名貴中藥,為蟾蜍科動物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液,經(jīng)加工干燥制成。蟾酥化學(xué)成分很復(fù)雜，在蟾酥近百種已鑒定結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分中,其中3種化合物包括蟾蜍靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基有較明顯的體外抗腫瘤作用。文獻(xiàn)報(bào)道，蟾酥對白血病、胃癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤有顯著的抗腫瘤作用，還能不同程度地防治化療和放療引起的白細(xì)胞下降，在腫瘤治療中有較好的發(fā)展前景[1，2]。研究表明,蟾毒內(nèi)酯類可能通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，干擾癌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成等而起抗腫瘤作用[3,5]。但迄今為止，人們對蟾酥抗癌機(jī)制認(rèn)識不深，因此限制了將蟾毒內(nèi)酯類開發(fā)應(yīng)用于臨床癌癥治療。

CBG是蟾酥中的一種活性單體，實(shí)驗(yàn)證明其具有抗白血病和抗肝癌作用。微量的CBG可誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞凋亡,有顯著的抑制生長作用[5]。CBG的抗癌作用機(jī)制可能是多方面的,誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期G2/M期阻滯可能是CBG抑制肝癌細(xì)胞增殖的重要機(jī)制，CBG可使人肝癌SMMC-7721和BEL-7402細(xì)胞停滯于G2/M期,減少S期的細(xì)胞比例,減少肝癌細(xì)胞S期DNA含量及增殖指數(shù),并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[4,6]，提示CBG可能通過影響細(xì)胞周期進(jìn)程而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CBG誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了CBG的抗鼻咽癌作用,表明CBG是中藥蟾酥的主要抗腫瘤成分之一。

我們前期的研究工作表明， Cl-通道在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞遷移等重要生理病理過程中起重要作用[7-9]。鼻咽癌主要化療藥物-順鉑誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，激活細(xì)胞膜Cl-通道[4,10]。近年來越來越多證據(jù)表明，Cl-通道的激活是細(xì)胞凋亡發(fā)生過程的一個(gè)交匯點(diǎn)，在細(xì)胞凋亡早期觸發(fā)機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。在凋亡早期，Cl-通道和K+通道被激活，引起Cl-和K+外流，同時(shí)伴隨水的外流而導(dǎo)致凋亡性細(xì)胞皺縮，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Cl-通道和K+通道的激活是細(xì)胞凋亡性生化變化的上游事件，激活Cl-通道和K+通道，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡性容積減小是抗癌藥作用的潛在的新靶點(diǎn)。蟾酥可否通過激活Cl-通道而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡？目前國內(nèi)外尚沒有相關(guān)的報(bào)道。為了研究Cl-通道在華蟾酥毒基抗腫瘤中的作用，本實(shí)驗(yàn)觀察了華蟾酥毒基對氯通道的作用，以及阻斷Cl-通道對華蟾酥毒基誘導(dǎo)凋亡和凋亡性容積減小作用的影響。結(jié)果表明，華蟾酥毒基可激活氯通道，氯通道阻斷劑NPPB可以顯著地抑制華蟾酥毒基誘導(dǎo)的氯電流，拮抗華蟾酥毒基引起的細(xì)胞凋亡性容積減小和細(xì)胞凋亡，提示華蟾酥毒基可能通過激活氯通道而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，氯通道在華蟾酥毒基抗腫瘤中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)的完成，加深了我們對華蟾酥毒基的抗癌機(jī)制的認(rèn)識，為研發(fā)離子通道介導(dǎo)的蟾毒內(nèi)酯類化合物抗腫瘤藥物提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Rolesofchloridechannelsinapoptosisinducedbycinobufagininnasopharyngealcarcinomacells

BAI Zhi-quan1,LI Chun-ying1,LI Yuan2,MA Wen-bo1,ZHU Lin-yan2,YE Wen-cai3,ZHANG Dong-mei3,WANG Li-wei1,CHEN Li-xin2

(1DepartmentofPhysiology,2Departmentofpharmacology,SchoolofMedicine,3InstituteofTraditionalChineseMedicineandNaturalProducts,CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:wangliweic@sohu.com;chenlixinw@sohu.com)

AIM: To investigate the roles of chloride channels in the apoptosis and apoptotic volume decrease(AVD) induced by cinobufagin in nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells.METHODSFive experimental groups in this study were set up,including control group,cinobufagin groups treated with low,medium or high concentration of cinobufagin alone,and the combination group treated with cinobufagin and the chloride channel blocker 5-nitro-2- (3-phenylpropylamino) -benzoate (NPPB).Apoptotic rates were detected by Hoechst 33342 staining and the volume changes were measured by the method of time-lapse live cell imaging.The patch clamp technique was used to record whole-cell chloride currents.RESULTSCinobufagin induced apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells in a concentration-dependent manner.The apoptotic rate was 43.2％ in the cells treated with cinobufagin at high concentration (8 μmol/L).An AVD was observed in the cells treated with cinobufagin.Cinobufagin decreased the cell volume by 9.9％ in 50 min and activated a chloride current which did not show significant outward rectification.The chloride channel blocker NPPB inhibited the cinobufagin-induced apoptosis,AVD and chloride currents.NPPB decreased the cinobufagin-induced apoptosis and AVD by 80.1％ and 74.8％,respectively.CONCLUSIONOur findings suggest that cinobufagin induces apoptosis by activation of chloride channels,which may play an important role in the anti-tumour action of cinobufagin.

Cinobufagin; Apoptosis; Chloride channels; Apoptotic volume decrease

1000-4718(2011)05-0833-05

R739.63

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.001

2011-02-27

2011-04-19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No.30771106；No.30870567；No.30871267；No.90913020；No.U0932004)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.07005974)

△通訊作者 Tel: 020-85220260；E-mail: wangliweic@sohu.com; Tel: 020-85228865；E-mail: chenlixinw@sohu.com

▲ 并列第1作者