樂(lè) 亮， 李晶潔， 黎仕鋒， 朱文博， 束敏峰， 蘇興文， 邱鵬新， 顏光美

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州510082)

帕金森病(Parkinson diseases，PD)是一種常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)性疾病。PD 以運(yùn)動(dòng)減少、肌張力強(qiáng)直和震顫為主要癥狀;以中腦黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性缺失并伴有Lewy 小體生成為主要病理特征［1－3］。長(zhǎng)期以來(lái)，研究者針對(duì)神經(jīng)元的壞死和凋亡，期望開發(fā)一種有效的神經(jīng)保護(hù)劑。近幾年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)四環(huán)素的衍生物－ 米諾環(huán)素(minocycline)具有顯著的抗炎、抗凋亡和抗氧化等作用，可能成為一種有效的多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)劑［4－6］。本實(shí)驗(yàn)以PC12 細(xì)胞為多巴胺能神經(jīng)元模型，觀察米諾環(huán)素對(duì)1－甲基－4－苯基吡啶離子(1－methyl－4－phenylpyridinium ion，MPP+)誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞的線粒體功能損傷的保護(hù)作用，為米諾環(huán)素應(yīng)用于PD的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 PC12 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

PC12 細(xì)胞(由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理教研室提供)置于含10%馬血清(Gibco)和5%胎牛血清(Gibco)、1 ×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RMPI－1640(Gibco)培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

傳代的PC12 細(xì)胞加入100 μg/L NGF，并培養(yǎng)在含膠原蛋白鋪板的細(xì)胞板內(nèi)，經(jīng)7－8 d 的誘導(dǎo)分化，長(zhǎng)出突觸，用于實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)分化后的PC12 細(xì)胞分別先用終濃度為0、0.01、0.1、1、10 μmol/L minocycline預(yù)處理30 min，然后加入0.5 mmol/L 的MPP+，再置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用于實(shí)驗(yàn)。

2 甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活性

PC12 細(xì)胞按密度為1 ×108cells/L、100 μL/well接種于96 孔板。經(jīng)誘導(dǎo)分化并給藥處理后，每孔加入5 g/L MTT(Sigma)溶液20 μL。37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱放置4 h 后棄去培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(Sigma)100 μL。振蕩10 min 后，用酶標(biāo)儀(BioTek，Burlington，VT)在570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值(A值)。最后按公式:細(xì)胞的存活率=(給藥組A 值/對(duì)照組A 值)×100%計(jì)算得出各組的細(xì)胞生存率。

3 Hoechst 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

PC12 細(xì)胞經(jīng)處理后，用4% 多聚甲醛固定10 min，使用5 mg/L Hoechst 33258 暗處染色15 min，在熒光顯微鏡下，以340 nm 的激發(fā)光波長(zhǎng)觀察染色情況，并計(jì)算細(xì)胞核形態(tài)改變所占比例。

4 PC12 細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的測(cè)定

DCFH－DA 本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH 不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無(wú)熒光的DCFH 生成有熒光的DCF。檢測(cè)DCF 的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。PC12 細(xì)胞經(jīng)處理后，棄去培養(yǎng)基，96 孔板的細(xì)胞培養(yǎng)板中加入終濃度為10 μmol/L DCFH－DA(活性氧檢測(cè)試劑盒，碧云天)100 μL/well。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無(wú)血清的培養(yǎng)基洗滌3 次，用多功能酶標(biāo)儀(Infinite F500，奧地利)，以488 nm 的激發(fā)光、525 nm 的發(fā)射光測(cè)定每孔的熒光強(qiáng)度。以(給藥組/對(duì)照組)×100%的比率作為活性氧變化的指標(biāo)。

5 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，Δψm)分析

JC－1 是一種廣泛用于檢測(cè)Δψm的理想熒光探針。可以檢測(cè)細(xì)胞的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC－1 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時(shí)，JC－1 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC－1 為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。常用綠紅熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例［7］。孵育在6 孔板的PC12 細(xì)胞經(jīng)給藥處理24 h 后，去除培養(yǎng)基，加入等體積的JC－1(5 mg/L)，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用PBS 洗2 次。用激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss)，以激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)545 nm檢測(cè)綠紅熒光強(qiáng)度，以綠紅熒光強(qiáng)度比值反映線粒體膜電位的變化。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 Minocycline 對(duì)PC12 細(xì)胞活性的影響

Figure 1. The protective effect of minocycline at 0. 1，1 and 10 μmol/L on decreased cell viability induced by 0.5 mmol/L MPP + in PC12 cells. PC12 cells were pretreated with 0.1，1 and 10 μmol/L minocycline for 30 min prior to 0.5 mmol/L MPP + treatment for 24 h，and then MTT assay was used to determine cell viability. ±s. n =5. ＊＊P ＜0.01 vs control group;## P ＜0.01 vs MPP + group.圖1 不同濃度minocycline 預(yù)處理對(duì)MPP +誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞活性下降的影響

由圖1 可知，0.5 mmol/L MPP+處理PC12 細(xì)胞24 h 后，80.8%的細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制，與不加任何處理的細(xì)胞比較差異顯著。而在用minocycline 預(yù)處理30 min 后，再用0.5 mmol/L MPP+處理，則PC12細(xì)胞的存活率明顯提高，并隨minocycline 濃度的升高有呈明顯劑量依賴性。Minocycline 的濃度0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L 時(shí)，分別只有40.7%、28.8%、22.1%的細(xì)胞死亡，相對(duì)單用MPP+處理，分別提高了40.1%、54.0%、58.7%的細(xì)胞存活率。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，給藥組分別與MPP+組相比，差異顯著(P ＜0.01)，說(shuō)明minocycline 能明顯改善由MPP+引起的細(xì)胞活性下降。

2 Minocycline 對(duì)PC12 細(xì)胞凋亡的影響

如圖2 所示，在0.5 mmol/L MPP+處理24 h 后，PC12 細(xì)胞經(jīng)Hoechst 染色可以明顯看到有凋亡現(xiàn)象發(fā)生，凋亡率為5.22%，與對(duì)照組的0.57%的凋亡率比較明顯升高;而經(jīng)10 μmol/L minocycline 預(yù)處理30 min 再用0.5 mmol/L MPP+處理24 h，則PC12 細(xì)胞的凋亡數(shù)明顯減少，凋亡率僅為0.91%，與對(duì)照組接近。顯然，minocycline 預(yù)處理能明顯抑制MPP+引起的PC12 細(xì)胞凋亡。

Figure 2. Minocycline inhibited the apoptosis of PC12 cells induced by MPP +. A:the apoptotic morphological changes of PC12 cells were induced by MPP +，however，pretreatment with 10 μmol/L minocycline blocked these changes(×100);B:quantitative analysis of apoptotic cells. ±s.n=5. ＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs MPP + group.圖2 Minocycline 對(duì)PC12 細(xì)胞凋亡的影響

3 Minocycline 抑制MPP+ 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞內(nèi)ROS 聚集

如圖3 所示，0.5 mmol/L MPP+處理PC12 細(xì)胞24 h，能引起ROS 的大量聚集，與正常細(xì)胞比較增加230.0%，而預(yù)處理0.1、1、10 μmol/L minocycline 與正常組比較，ROS 分別只有143.7%、91.1%、93.8%，和MPP+組相比，都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)。表明minocycline 能明顯抑制MPP+誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞內(nèi)ROS 聚集。

4 Minocycline 抑制MPP+引起的PC12 細(xì)胞線粒體膜電位去極化

線粒體去極化時(shí)，由于JC－1 進(jìn)入線粒體內(nèi)減少，不能形成聚集，致使綠/紅熒光強(qiáng)度的比例上升。在正常PC12 細(xì)胞中，綠/紅熒光強(qiáng)度比僅為0.38，見(jiàn)圖4，而用0.5 mmol/L MPP+處理24 h 后，綠/紅熒光強(qiáng)度比則迅速上升為11.95，線粒體迅速去極化。而minocycline 預(yù)處理30 min，再加入0.5 mmol/L MPP+則綠/紅熒光強(qiáng)度比降為6.72，與單用MPP+比較差異顯著，說(shuō)明minocycline 抑制MPP+誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞線粒體膜電位去極化。但與正常組比較差異顯著(P ＜0.01)，說(shuō)明用minocycline 預(yù)處理并不能完全阻斷MPP+誘導(dǎo)的線粒體膜電位去極化。

討 論

PD 是繼阿爾茨海默病之后影響老年人身心健康的第二大神經(jīng)退行性功能障礙疾?。?］。PD 的平均發(fā)病年齡在55 歲，并隨年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病率從20/10 萬(wàn)增長(zhǎng)至120/10 萬(wàn)。在65 歲以上人群中，PD 發(fā)病率最高達(dá)1%［2］。目前對(duì)于PD 的發(fā)病機(jī)制眾說(shuō)紛紜［9］，有研究顯示，線粒體功能性障礙和氧化應(yīng)激可能與PD 的發(fā)病有關(guān)［10，11］。

Figure 3. The inhibitory effect of minocycline at 0.1，1 and 10 μmol/L on intracellular ROS increasing induced by 0.5 mmol/L MPP + in PC12 cells. PC12 cells were pretreated with 0.1，1 and 10 μmol/L minocycline for 30 min prior to 0.5 mmol/L MPP + treatment for 24 h，and then DCFH－DA probe was used to determine intracellular ROS. ± s. n =5. ＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs MPP + group.圖3 Minocycline 對(duì)PC12 細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響

Figure 4. Minocycline attenuated mitochondrial membrane potentials in PC12 cells induced by MPP +. A:photographs of JC－1 staining in the three groups(×400);B:quantitative analysis of the ratio of mitochondrial green fluorescence to red fluorescence among groups. ±s.n=5. ＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs MPP + group.圖4 Minocycline 對(duì)PC12 細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Minocycline 是第二代四環(huán)素類抗生素，具有較高的脂溶性，能順利透過(guò)血腦屏障。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)minocycline 具有抗凋亡和抗氧化的作用，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和壞死模型，觀察minocycline 預(yù)處理的保護(hù)作用。PC12 細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系，富含酪氨酸羥化酶、單胺氧化酶和兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)NGF 誘導(dǎo)產(chǎn)生突觸，具有神經(jīng)分泌細(xì)胞和神經(jīng)元的性質(zhì)。因此PC12 細(xì)胞被廣泛用于PD 的研究。

MPP+是建立PD 細(xì)胞模型的常用工具藥，能誘導(dǎo)線粒體功能障礙和氧自由基生成增加。本實(shí)驗(yàn)用0.5 mmol/L MPP+處理細(xì)胞24 h 后，MTT 檢測(cè)細(xì)胞活性，80.8%的細(xì)胞死亡，而Hoechst 染色計(jì)數(shù)顯示5.22%的細(xì)胞發(fā)生凋亡，說(shuō)明0.5 mmol/L MPP+處理PC12 細(xì)胞24 h，既能誘導(dǎo)凋亡，也可導(dǎo)致細(xì)胞壞死，且細(xì)胞壞死占多數(shù)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，minocycline 預(yù)處理30 min，可明顯改善細(xì)胞活性，并具有劑量依賴性，在給以10 μmol/L minocycline 時(shí)，細(xì)胞存活率最大，為77.9%。這與Lin 等［12］的研究相符。同時(shí)，細(xì)胞凋亡從5.22%降到0.91%，說(shuō)明minocycline 具有顯著保護(hù)PC12 細(xì)胞凋亡的作用，但目前對(duì)其抗凋亡機(jī)制尚無(wú)定論。Zhu 等［13］研究表明minocycline 可以抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換介導(dǎo)(permeability transition－ mediated)的細(xì)胞色素C 的釋放，從而抑制caspase－1 和caspase－3 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，延緩肌萎縮性側(cè)索硬化小鼠的病情進(jìn)展。

線粒體內(nèi)膜分布著大量質(zhì)子泵，其功能是將基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子H+泵入外室，從而形成橫跨內(nèi)膜的ΔΨm，以維持線粒體的正常功能。ΔΨm的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore)，其開放需要Ca2+的參與。使用MPP+處理后，線粒體復(fù)合物I 活性下降，線粒體基質(zhì)內(nèi)氧化磷酸化反應(yīng)減少，ATP 產(chǎn)生減少，H+生成受抑制，其ΔΨm發(fā)生改變，線粒體膜電位去極化，pH 值升高，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。N－methyl－D－aspartate (NMDA)受體功能可能與MPP+介導(dǎo)的神經(jīng)毒性有關(guān)［14］，而minocycline 能夠抑制NMDA 介導(dǎo)的神經(jīng)毒性［12］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)minocycline 能夠抑制MPP+誘導(dǎo)的線粒體膜電位去極化，從而保護(hù)細(xì)胞。

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