李樹清， 羅海蕓， 俞志成

(昆明醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，云南 昆明650031)

腦缺血治療“時間窗”的選擇一直是國內(nèi)外腦血管病治療研究的難點和重點。腦缺血超早期(缺血4 h)、平穩(wěn)期(缺血24 h)及恢復(fù)期(缺血72 h 后)的研究顯示，神經(jīng)元的損傷隨缺血時間的延長而加重;而選擇缺血后6 h 或更早時機進行干預(yù)，已成為腦缺血治療“時間窗”探索重要領(lǐng)域。業(yè)已證明，缺血后適應(yīng)(postconditioning，PC)的腦保護效應(yīng)可能與延長治療“時間窗”，緩解神經(jīng)元損傷進程有關(guān)。新近研究表明，缺血PC 的實施效果不僅取決于循環(huán)的數(shù)量(即開夾再灌注的次數(shù))，還取決于每次灌注持續(xù)時間以及實施PC 的時機選擇［1，2］。當(dāng)前缺血PC 的實施多采用開顱閉塞大腦中動脈及其隨后瞬間夾閉/開放血管數(shù)次的方式實施PC［3，4］，與臨床腦缺血后4 h 的超早期“時間窗”相距甚遠(yuǎn)。為此，本研究選擇缺血后4 h 作為實施PC 的“時間窗”，比較永久性大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)與血栓性腦缺血(thrombotic cerebral ischemia，TC)模型的PC 效果，以探討其發(fā)生發(fā)展的病理生理機制。

材 料 和 方 法

1 動物與分組

健康成年樹鼩73 只，雌雄不拘，體重(120±20)g;隨機分為對照組(n =10，僅手術(shù)而不做光化學(xué)反應(yīng));TC 組(n =15，其中4 h、24 h 及72 h 各5只);MCAO 組(n =15，其中4 h、24 h 及72 h 各5只);TC+PC 組(n =15，其中4 h、24 h 及72 h 各5只);MCAO+PC 組(n=15，其中4 h、24 h 及72 h 各5 只)。另取3 只動物進行TTT 染色。

2 主要儀器

2.1 SQ-Ⅲ型光化學(xué)誘導(dǎo)腦血栓形成裝置(本教研室研制)［3］由光源(含濾波電路及觸發(fā)器)、萬能支架、數(shù)控光源、散熱裝置以及光學(xué)系統(tǒng)(包括干涉濾鏡及聚光透鏡)組成。光源中心波長(λ)560 nm，帶寬(Δλ)60 nm，光強度(1.0 W/cm2)，用時間繼電器控制照射時間。

2.2 JEM -1011 型電子顯微鏡(日立產(chǎn)品) Peri-Flux System 5000 型雙通道LD 血流測定儀(Perimed)，含PF5010 模塊和接觸式探頭(PF5010 LDPM Unit)。探頭最大輸出功率:1 mW;波長780 nm;波段:20 Hz-20 kHz;倍頻程:12 kHz-21 DB/octave。

2.3 血壓換能器及MEDLINE 血壓描記系統(tǒng) 南京建成生物系統(tǒng)研制。

3 試劑和材料

孟加拉紅(Rose Bengal)購自Fluka，以0.85%生理鹽水溶解，濃度為1.5 g·L-1，避光冷藏保存。

4 方法

4.1 樹鼩TC 模型的建立［5］以2.5%硫噴妥鈉40 mg·kg-1腹腔注射麻醉動物，固定于自制的小動物臺上，消毒右頂部皮膚、矢狀切開1 cm、分離顳肌，小心分離骨膜以免損傷顱骨表面出血而影響其透光性。于切口處嵌一外徑2.5 cm 的消毒鋁片，其中有一孔徑0.5 cm 的窗孔，以便光束透照于顱骨表面。至此，于實驗組動物舌下靜脈注射孟加拉紅生理鹽水1.33 mL·kg-1，循環(huán)10 min，用SQ-Ⅲ型腦血栓形成裝置照射暴露的顱骨表面10 min，其溫度控制在(37.0 ± 0.1)℃，照畢，縫合皮膚、保溫待動物清醒后放回飼養(yǎng)籠內(nèi)觀察。

4.2 樹鼩MCAO 模型的建立 參照李樹清等［6］的方法實施MCAO。將樹鼩常規(guī)麻醉、固定。左側(cè)臥位固定并于右側(cè)面部備皮，在LM -1 型無影燈放大鏡下用自制蝶形小拉鉤擴開右眼上下眼瞼，充分暴露眼眶并摘除眼球;透過半透明的顱骨板可見大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)走向，用細(xì)鋼針于距視神經(jīng)孔1 mm 處的顱骨板上鉆2 個小孔使之與顱骨下的MCA 相交，再將小孔間相連的外骨板切開。至此，用高頻電刀對準(zhǔn)外骨板小口下的MCA 位置啟動開關(guān)凝閉MCA。此后用棉球填塞眼眶，縫合創(chuàng)口置飼養(yǎng)籠觀察。

4.3 電鏡觀察 每組動物于規(guī)定時間麻醉，小心剪開顱骨取出缺血側(cè)(右側(cè))海馬，置于3.5%戊二醛內(nèi)保存，磷酸鹽緩沖液沖洗后，丙酮酸逐級脫水，1%四氧鋨酸固定24 h，LKBS 型超薄切片機半薄切片定位，再作檸檬酸鉛醋酸鈾雙染色，在JEM-1011 型電子顯微鏡下觀察海馬超微結(jié)構(gòu)(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體)。

4.4 樹鼩海馬局部腦血流(regional cerebral blood flow，rCBF)測定 分別將各組動物于既定時點前2.5 h 重新麻醉，使用KW- II 型腦立體定位儀固定動物，以電極固定器夾持套管針;以法蘭克福平面(Frankfurt plane，耳眼水平面)作為立體定位坐標(biāo)系統(tǒng)的基礎(chǔ)，這一平面通過外耳道的中心以及眶口的下緣，冠狀面與法蘭克福平面垂直并同時通過2 個外耳道的中心，形成AP 0.0 平面;選擇右側(cè)海馬為灌流部位，以AP 0.0 平面前2.5 mm (A2.5)、中線左(右)側(cè)6.5 mm (L 6.5 或R 6.5 )坐標(biāo)點處為穿刺點，鉆開顱骨(Φl mm);使用數(shù)字式微電極驅(qū)動器控制，自硬腦膜表面向下垂直進針8.0 mm (H8.0)至海馬，取出套針，并植入激光多普勒血流儀探頭，用PeriFlux System 5000 型LD 血流儀及Perimed 公司提供的Perisoft 配套軟件(Windows，Software version 2.50)進行曲線輸出記錄，將采集信號轉(zhuǎn)換成血流灌注單位(perfusion unit，PU)［=運動紅細(xì)胞的濃度(concentration of moving blood cells，CMBC)×平均血細(xì)胞的移動速率(velocity of blood cells，V)］，利用套管使探頭置于海馬CA1 區(qū)，保持穩(wěn)定測量30 s，選取穩(wěn)定記錄血流曲線300 s，作為海馬CA1 區(qū)的血流值，所有數(shù)據(jù)取平均值為rCBF。當(dāng)激光多普勒撞擊到運動的血細(xì)胞，將發(fā)生多普勒頻移。對接收光纖接收到的反射激光進行分析并顯示灌注量值即PU［7］。

5 建立缺血PC 模型

樹鼩腦缺血后4 h，將麻醉動物固定，行頸前正中切口，分離缺血側(cè)(右側(cè))頸總動脈，用無創(chuàng)動脈夾將其夾閉5 min/再灌注5 min，重復(fù)3 次。同時用激光多普勒血流儀連續(xù)觀察海馬rCBF，見圖1。

Figure 1. The protocols for postconditioning in TC and MCAO group.圖1 TC 和MCAO 組的PC 模型建立

6 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 血栓形成與MCAO 缺血模型的TTC 染色結(jié)果

TTC 染色顯示:血栓性腦缺血24 h 時TTC 染色顯示缺血區(qū)呈蒼白色，其范圍與光化學(xué)反應(yīng)區(qū)基本一致，見圖2A 箭頭所示;冠狀切面可見梗塞部位以皮層為主。MCAO 性腦缺血24 h 時TTC 染色可見梗塞區(qū)與中動脈供血區(qū)域相吻合，梗塞面積過大，相當(dāng)于患側(cè)半球的2/3，見圖2B 箭頭所示為被凝閉的MCA 主干。

Figure 2. Comparison of infarct size in TC (A)and MCAO (B)24 h after cerebral ischemia in tree shrews.圖2 樹鼩TC(A)和MCAO(B)后24 h 腦梗塞面積的比較

2 PC 對血栓及MCAO 腦缺血海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變的影響

TC 與MCAO 后海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)改變以線粒體腫脹、嵴斷裂以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張為主，其中以缺血24 h 的改變?yōu)橹?而細(xì)胞損傷的程度則以MCAO 組最明顯。TC 后24 h 可見明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池形成，神經(jīng)元固縮，見圖3C。TC + PC 24 h 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)接近正常，但部分線粒體腫脹，嵴斷裂，見圖3D。MCAO 24 h 神經(jīng)元胞質(zhì)水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池形成，線粒體腫脹，見圖3E;MCAO + PC 24 h 神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池形成，神經(jīng)氈水腫，見圖3F。PC 緩減血栓性腦缺血組海馬線粒體損傷的作用較MCAO 組明顯，見圖3。

3 PC 對血栓及MCAO 腦缺血海馬rCBF 改變的影響

研究結(jié)果顯示，TC 與MCAO 組海馬rCBF 降低的程度與時間有明顯不同，在同一時點MCAO 組海馬rCBF 降低的程度明顯大于TC 組。MCAO 組凝閉腦血管后4 h、24 h 及72 h 海馬rCBF 分別為(3.45±0.45)PU、(1.51 ±0.44)PU 和(1.06 ±0.03)PU(P ＜0.01);TC 組光化學(xué)反應(yīng)后4 h、24 h 及72 h 海馬rCBF 分別為(5.80 ±0.26 )PU、(2.55 ±0.28 )PU和(9.84 ±1.22)PU(P ＜0.01)。實施PC 后MCAO組與TC 組的rCBF 均有升高，但以TC 組的變化為著，其4 h、24 h 及72 h 的rCBF 分別為(7.20 ±0.66)PU、(10.42 ±3.75)PU(P ＜0.01)、(18.74 ±1.60)PU(P ＜0.01)，呈進行性增加趨勢。而MCAO實施PC 后除4 h 的rCBF 有所增加［(5.68 ±0.30)PU］以外，其余時間的rCBF 呈進行性降低，72 h 降至(2.40 ±0.39)PU，見圖4、5。

Figure 3. The normal neurons(A，×5 000)of hippocampus and mitochondria(B，×25 000).The endoplasmic reticulum pool formation and neuron-shrinkage 24 h after TC(C，×25 000)and MCAO(E，×25 000).The abnormal changes of endoplasmic reticulum and mitochondria swelling and ridge ruptures were reduced at 24 h in TC+ PC group(D，×25 000)，but the endoplasmic reticulum pool formation and neuropil edema at 24 h in MCAO + PC group(F，×25 000).圖3 PC 對TC 及MCAO 腦缺血海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變的影響

Figure 4. Effect of ischemic PC on rCBF in TC group. ±s.n =5. ＊＊P ＜0.01 vs control;△△P ＜0.01 vs TC group.圖4 缺血PC 對TC 組rCBF 的影響

討 論

Figure 5. Effect of ischemic PC on rCBF in MCAO group. ±s.n=5. ＊＊P ＜0. 01 vs control;△P ＜0. 05 vs MCAO group.圖5 缺血PC 對MCAO 組rCBF 的影響

近年的研究顯示，后適應(yīng)的實施時機對神經(jīng)保護作用極其重要。缺血PC 的實施效果既取決于開夾再灌注的次數(shù))，又取決于每次灌注持續(xù)時間，尤其是選擇PC 的時機。Pignataro 等［8］通過阻塞大腦中動脈100 min 后開夾2 min /閉塞2 min，再灌注2 min(重復(fù)5 個循環(huán))實施腦缺血后適應(yīng)可使腦梗塞面積減少23%，無統(tǒng)計學(xué)意義;開夾5 min/閉塞5 min，再灌注5 min(重復(fù)3 次)，梗塞面積減少38%;開夾10 min/閉塞10 min (循環(huán)1 次)，梗塞面積減少達(dá)65%;開夾30 min/閉塞10 min (循環(huán)1 次)，則無保護作用。由此可見，實施后適應(yīng)的時機是影響大腦神經(jīng)保護的關(guān)鍵因素之一。我們的前期研究證明，光化學(xué)誘導(dǎo)血栓性局部腦缺血時海馬的缺血性改變十分明顯［9］;采用反復(fù)夾閉缺血遠(yuǎn)隔區(qū)的頸總動脈3 次(每次5 min)的方式實施PC，可使缺血后72 h 時海馬rCBF 自然回升至正常對照的56%以上，為夾閉遠(yuǎn)離缺血部位的頸總動脈改善海馬CA1 區(qū)的血液供應(yīng)提供了直接證據(jù)。

本研究證實，缺血PC 對MCAO 模型的海馬神經(jīng)元保護效應(yīng)不及TC 模型明顯，可能由于MCA 閉塞發(fā)生于一瞬間，其組織損傷的程度明顯增強，且隨時間的延長rCBF 進行性下降，以致缺血72 h 達(dá)最低點。然而，與MCAO 不同，TC 為局部血小板聚集、血栓形成、局部血流供應(yīng)減少所致，其發(fā)病過程呈漸進性，組織損傷的程度顯然不及MCAO 組嚴(yán)重，是實施PC 腦保護的重要基礎(chǔ)。TC 時海馬rCBF 在一定時間內(nèi)可隨時間的延長而下降，但由于缺血局部成生的擴血管物質(zhì)，既有助于血管擴張又有利于側(cè)支循環(huán)的建立，可能是缺血72 h 海馬rCBF 增加的主要原因。我們的研究已證實PC 的機制可能包括“機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”和體內(nèi)血液重新分布兩方面［10］，而MCAO所致的腦缺血為一種機械性、完全性的血管阻塞，不利于后適應(yīng)介導(dǎo)的機械信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，開夾時自頸總動脈進入顱內(nèi)的血流無法到達(dá)海馬，正是后適應(yīng)對MCAO 所致腦缺血時海馬rCBF 難于改善的機理所在。近年研究發(fā)現(xiàn)，血管機械張力可加快來自心臟的快速誘導(dǎo)型蛋白激酶-血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1(serum and glucocorticoid - inducible kinase-1，SGK1)的活化［1］。SGK1 作為多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的功能交匯點參與了人體許多重要生理功能［11］，其與蛋白激酶B (PKB/Akt)具有極強的同源性，活化的SGK1 可抑制心肌細(xì)胞凋亡，激活A(yù)kt 途經(jīng)可抑制神經(jīng)元凋亡［12］。PC的保護效應(yīng)可能與夾閉頸總動脈產(chǎn)生機械張力繼而激活SGK1 有關(guān)。

本實驗表明，PC 的腦保護效果具有模型與時間的選擇性，MCAO 組的PC 效果顯然不及TC 組明顯。通過夾閉缺血遠(yuǎn)隔區(qū)的頸總動脈3 次(每次5 min)實施PC 的方式具有簡便易行、改善腦缺血效果好的優(yōu)點。與TC 組相比，MCAO 的PC 效果較差可能與其缺血的細(xì)胞與細(xì)胞間的信號聯(lián)系以及細(xì)胞與基質(zhì)相互作用所介導(dǎo)全身“神經(jīng)-血管單元(neurovascular unit)”反應(yīng)障礙有關(guān)［13］。然而，臨床應(yīng)用缺血后適應(yīng)調(diào)控神經(jīng)損傷的可行性仍值得進一步探索，若未獲得反復(fù)循環(huán)的最佳再灌注，對某些患者可能具有一定危險性［14］。

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