李毅然 馬 亢

(商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 商丘 476000)

纖維素酶生產(chǎn)菌的篩選鑒定及其產(chǎn)酶影響因素研究*

李毅然 馬 亢

(商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 商丘 476000)

通過(guò)篩選從土壤和腐朽樹(shù)木中得到了4株纖維素酶高產(chǎn)菌株MF1、MF4、TF3和TF9，經(jīng)初步鑒定分別是綠色木霉、青霉屬、康氏木霉和黑曲霉。通過(guò)對(duì)TF3發(fā)酵產(chǎn)酶的影響因素研究表明，其發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳碳源是麩皮－纖維素粉復(fù)合物，最佳氮源是硫酸銨，最適發(fā)酵溫度范圍是30～32℃，最適初始pH范圍是6～7。

篩選;鑒定;纖維素酶;影響因素

當(dāng)今，石油等不可再生能源日益消耗，自然界中大量的纖維素資源越來(lái)越受到人們的青睞。纖維素類物質(zhì)自身所具備的可再生、廉價(jià)、豐富、分布廣、環(huán)保等特點(diǎn)，及其廣泛的用途，其價(jià)值不可估量［1，2］。而利用纖維素最有效的途徑是通過(guò)纖維素酶類進(jìn)行生物降解，該途徑經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、快速。纖維素酶是指能夠?qū)w維素類物質(zhì)進(jìn)行降解并生成葡萄糖的一類酶的總稱，是幾種具有不同酶活力的酶復(fù)合物，主要包括外切纖維素酶、內(nèi)切纖維素酶、β－葡萄糖苷酶等［3］。利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶將纖維素轉(zhuǎn)化為食品、能源和化工材料，對(duì)解決人類所面臨的諸多問(wèn)題具有極大的現(xiàn)實(shí)意義［4，5，6］。當(dāng)前，阻礙人類廣泛高效地利用纖維素的瓶頸，仍然是缺少纖維素酶的高產(chǎn)菌，因此，篩選具有高活性纖維素酶的微生物菌株仍是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)在參閱大量文獻(xiàn)和廣泛采樣的基礎(chǔ)上，分離到了4株纖維素酶活性較高的菌株，并對(duì)其產(chǎn)酶溫度和初始pH條件做了研究。

1.實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

樣品采自于商丘市伐木場(chǎng)鋸末堆下土壤、森林公園腐朽樹(shù)木，將樣品置于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行自然風(fēng)干，除去雜質(zhì)，粉碎，過(guò)篩，然后裝入樣品袋待用。所用試劑藥品均為市售分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基: (NH4)2SO41g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl20.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5mg，CMCNa 5g，葡萄糖2.5g，蛋白質(zhì)1g，蒸餾水1000ml。

篩選培養(yǎng)基:CMCNa 5 g，KCl 0.5g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.25g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5mg，NaNO33g，剛果紅0.05g，蛋白胨1g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000ml。

種子培養(yǎng)基:纖維素粉25g/L，麩皮20g/L，(NH4)2SO41.5g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基:CMC 7g/L，麩皮6g/L，(NH4)2SO42g/L，蛋白胨0.6g/L，吐溫 －80 1.5mL/L，KH2PO42g/L，CaCl20.3g/L，MgSO40.3g/L，Mn SO4·4 H2O 0.3 g/L，pH6。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:CMCNa 20g，KH2PO42g，(NH4)2SO42.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl2·2 H2O 0.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5mg，MnSO4·4 H2O 1.5mg，ZnSO4·7H2O 2mg，CoCl2·6 H2O 1.7mg，吐溫－80 1.5ml，蒸餾水1000ml，pH自然。

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，蔗糖20g，水1000ml。

1.1.3 溶液配制

檸檬酸緩沖液:稱取7.16 g Na2HPO4，溶于蒸餾水中，定容至100ml，即為0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液;稱取2.1g檸檬酸，溶于蒸餾水中，定容至100ml，即為0.1mol/L檸檬酸溶液。取0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液24.3ml和檸檬酸溶液25.7ml混勻。

羧甲基纖維素鈉溶液:準(zhǔn)確稱取羧甲基纖維素鈉2.0g，溶于200ml蒸餾水中，沸水浴中加熱至融化，過(guò)濾，取濾液150ml，加檸檬酸緩沖液30ml，蒸餾水60ml，混勻，置于冰箱中備用。

3，5—二硝基水楊酸顯色液［7］:按照文獻(xiàn)中提供的方法配制，貯存于棕色瓶中放置于冰箱中備用。

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液配制:準(zhǔn)確稱取已烘干的葡萄糖200.00mg，溶于蒸餾水中，定容至200.00ml。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種分離篩

取處理好的樣品10g放入裝有100mL無(wú)菌水和無(wú)菌玻璃珠的三角瓶中，振蕩10min后吸取上清液，將上清液接入富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng);取富集培養(yǎng)液，按梯度稀釋到10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，分別涂布到篩選平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng) 3 ～6d，挑取具有明顯水解圈的菌落進(jìn)行純化，并將純化后的菌株用斜面保存于4℃冰箱中;將保存的純化菌株制備成種子培養(yǎng)液，按照10%接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)各菌株酶活性高低進(jìn)行復(fù)篩，并將復(fù)篩得到的菌株進(jìn)行保存。

菌株靜定:將篩選出的菌株用平板進(jìn)行純培養(yǎng)，根據(jù)其菌落、菌絲、孢子形態(tài)及其生長(zhǎng)特性，依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》、《中國(guó)真菌志》、《菌物學(xué)概論》和《微生物學(xué)教程》等進(jìn)行分類鑒定。

1.2.2 CMCase和FPAase酶活測(cè)定

CMCase 和 FPAase 酶活測(cè)定參考趙玉萍［7］高培基［8］和張瑞萍［9］所提供的方法。

1.2.3 菌株產(chǎn)纖維素酶的影響因素研究

(1)不同碳、氮源培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)酶的影響

實(shí)驗(yàn)分別以稻草粉、麩皮、纖維素粉 (MCC)3種物質(zhì)及其復(fù)合物為碳源替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的CMCNa，不同碳源添加量均為20g/L，分別將不同碳源培養(yǎng)基裝入250mL錐形瓶中，按照5%接種比例接入菌種子液，在28℃下，160r/min震蕩培養(yǎng)120h，然后測(cè)定不同碳源的產(chǎn)酶量。

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加2.5g/L的硫酸銨、氯化銨、碳酸按、硝酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、牛肉膏、黃豆餅粉為氮源，其他物質(zhì)元素不變，培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)后測(cè)定不同氮源的產(chǎn)酶量。

(2)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵液培養(yǎng)基成份和其他培養(yǎng)條件同1.2.3.1，分別在25、28、30、32、35、38℃下發(fā)酵培養(yǎng)120h，測(cè)定不同培養(yǎng)溫度的產(chǎn)酶量。

(3)初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵液培養(yǎng)基成份和其他培養(yǎng)條件同1.2.3.1，分別將培養(yǎng)基初始pH調(diào)至3、4、5、6、7、8，振蕩培養(yǎng)120h，測(cè)定不同初始pH的產(chǎn)酶量。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 篩選菌株的纖維素酶產(chǎn)量

將初篩得到的9株真菌，按照5%接種比例接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，依據(jù)1.2.3.1中的培養(yǎng)條件，震蕩發(fā)酵培養(yǎng)120h后，測(cè)定各菌發(fā)酵液產(chǎn)酶量，得到產(chǎn)酶量較高的菌株有4株，該4株菌的產(chǎn)酶活性測(cè)定結(jié)果如表1所示。從表表1可以看出，復(fù)篩得到的4株菌，其中CMCase活性較高的是TF3，達(dá)到241.3IU/mL，F(xiàn)PAase活性較高的是TF9，達(dá)到7.8IU/mL。

表1 菌株發(fā)酵液的纖維素酶(CMCase和FPAase)活力Tab.1 The CMCase and FPAase activities of strains in fermentation broth

2.2 目的菌種形態(tài)學(xué)分析和鑒定

通過(guò)富集培養(yǎng)和平板篩選，分別從伐木場(chǎng)鋸末堆土壤和森林公園腐朽樹(shù)木中，初步篩選出9株具有較大透明圈的真菌。分別是MF1、MF4、TF3、TF9，其中MF1、MF4源于腐朽樹(shù)木，TF3、TF9源于鋸末堆土。

在PDA平板上培養(yǎng)MF1、MF4、TF3、TF9，并觀察各菌落生長(zhǎng)特征。其中MF1菌落初步形成白色絨毛狀，圓形，致密，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)中部變?yōu)榫G色，而后成為深綠色，隨生長(zhǎng)期進(jìn)一步延長(zhǎng)，菌落出現(xiàn)輪狀濃密的菌絲并產(chǎn)生大量孢子。菌落背面現(xiàn)灰色。孢子梗分枝少，呈次級(jí)單分枝并有彎曲。分生孢子較大呈球狀。通過(guò)比對(duì)，與綠色木霉的生長(zhǎng)特征最相似，初步鑒定為木霉屬，綠色木霉。MF4菌落初期呈現(xiàn)白色絮狀，而后變成灰綠色，菌落逐漸變厚，表面呈毛毯狀，外圈白色毛狀并向四周延伸。通過(guò)鏡檢，菌絲為白色有隔，分生孢子梗呈扇形輻射狀。初步鑒定為青霉屬。TF3菌落生長(zhǎng)初期為白色絨毛狀，呈圓形，致密，而后菌落中部變成綠色，菌落出現(xiàn)輪狀有白色菌絲，最后菌落變成黃綠色，菌落背面現(xiàn)微黃色。孢子梗束狀，有三級(jí)分枝，分生孢子呈橢圓狀。初步鑒定為木霉屬，康氏木霉。TF9菌落生長(zhǎng)初為白色，而后呈黑褐色厚絨毛狀，背面略呈黃色。分生孢子梗叢生，長(zhǎng)短不同，分生孢子球狀，黑褐色。初步鑒定為黑曲霉。

2.3 菌株TF3的發(fā)酵產(chǎn)酶影響因素分析

為進(jìn)一步考察所分離菌株的產(chǎn)酶能力，實(shí)驗(yàn)以TF3為研究對(duì)象，對(duì)菌株的主要發(fā)酵條件進(jìn)行了研究分析。

2.3.1 碳源、氮源對(duì)纖維素酶活性的影響

不同碳源對(duì)TF3產(chǎn)酶的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，不同碳源對(duì)產(chǎn)酶具有較明顯的影響。當(dāng)發(fā)酵液加麩皮和纖維素處理后，菌株的產(chǎn)酶活性量最高，CMCase活性達(dá)到278.1 IU/mL，F(xiàn)PAase活性達(dá)到8.9 IU/mL。因此，TF3菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的合適碳源為麩皮和纖維素粉的復(fù)合物。因?yàn)辂熎ぶ泻胸S富的微量元素，有利于菌體生長(zhǎng)，同時(shí)纖維素粉對(duì)纖維素酶生產(chǎn)具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。當(dāng)僅用稻草粉處理時(shí)，纖維素酶活性最低，其中CMCase活性只有117.2 IU/mL，CMCase活性僅為4.1 IU/mL?？梢?jiàn)，麩皮纖維素粉復(fù)合物與稻草粉之間差異最為顯著。添加稻草粉的CMCase活性和CMCase活性平均值分別是160.1 IU/mL和5.5 IU/mL，添加麩皮的CMCase活性和CMCase活性平均值分別是215.8 IU/mL和7.4 IU/mL，添加纖維素粉的CMCase活性和CMCase活性平均值分別是236.6 IU/mL和6.8 IU/mL。從以上數(shù)據(jù)來(lái)看，發(fā)酵液中添加纖維素粉有利于CMCase量的提高，添加麩皮有利于FPAase量的提高。

表2 不同碳源對(duì)TF3產(chǎn)酶的影響Table 1 Effect of different carbon sources on the cellulase production of TF3

不同氮源對(duì)TF3產(chǎn)酶的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，不同氮源對(duì)產(chǎn)酶也具有較大影響。從產(chǎn)酶活性大小可以得出，硫酸銨提供氮源時(shí)，產(chǎn)酶活性最高，黃豆餅粉作為氮源時(shí)，其產(chǎn)酶活性最低，可見(jiàn)發(fā)酵產(chǎn)酶的最適氮源為硫酸銨，其次是氯化銨?？傊@態(tài)氮產(chǎn)酶效果好于硝態(tài)氮，無(wú)機(jī)氮產(chǎn)酶效果好于有機(jī)氮。

表3 不同氮源對(duì)TF3產(chǎn)酶的影響Table 1 Effect of different nitrogen sources on celluase activity

2.3.2 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

實(shí)驗(yàn)研究測(cè)定了TF3在設(shè)定的梯度溫度下的產(chǎn)酶能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖示可以看出，溫度對(duì)TF3產(chǎn)酶能力有明顯影響，當(dāng)發(fā)酵溫度為32℃時(shí)，CMCase活性最高達(dá)到261.7 IU/mL;當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，F(xiàn)PAase活性最高，達(dá)到7.3 IU/mL。當(dāng)發(fā)酵溫度過(guò)低或過(guò)高時(shí)，CMCase和FPAase活性都顯著降低，因?yàn)榘l(fā)酵液溫度過(guò)低時(shí)，不利于微生物的快速生長(zhǎng)，蛋白質(zhì)合成受到抑制，從而影響產(chǎn)酶量;相反，當(dāng)發(fā)酵液溫度過(guò)高時(shí)，加快了酶蛋白的變性速度，從而使酶活性喪失?？梢?jiàn)，TF3發(fā)酵產(chǎn)酶的適宜溫度在30～32℃范圍內(nèi)。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.1 Effect of incubating temperature on the cellulase production

2.3.3 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

實(shí)驗(yàn)研究測(cè)定了TF3在不同初始pH發(fā)酵產(chǎn)酶能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖示可以看出，發(fā)酵液初始pH對(duì)產(chǎn)酶量具有明顯影響，當(dāng)發(fā)酵液初始pH為6時(shí)，CMCase活性最高，達(dá)到248.3 IU/mL;當(dāng)發(fā)酵液初始pH為7時(shí)，F(xiàn)PAase酶活達(dá)到最高值7.5 IU/mL。可見(jiàn)，TF3發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最適初始pH范圍大致在6～7之間。

圖2 初始pH對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.1 Effect of initial pH on the cellulase production

3.結(jié)論

通過(guò)初篩和復(fù)篩，分別從伐木場(chǎng)鋸末堆下土壤和森林公園腐木中篩選得到了4株產(chǎn)纖維素酶活性較高的菌株，經(jīng)初步鑒定，本別是綠色木霉－MF1、青霉屬－MF4、康氏木霉－TF3、黑曲霉－TF9，詳見(jiàn)表1。通過(guò)研究考察了碳源、氮源、溫度和初始pH對(duì)TF3產(chǎn)酶的影響，結(jié)果顯示，TF3發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳碳源為麩皮纖維素復(fù)合物，最佳氮源為硫酸銨，最適發(fā)酵溫度范圍是30～32℃，發(fā)酵液最適初始pH范圍是6～7。

實(shí)驗(yàn)僅從溫度和初始pH兩個(gè)方面研究了它們對(duì)TF3產(chǎn)酶的影響，要進(jìn)一步該株菌的產(chǎn)酶潛力大小，還需要對(duì)更多的因素及其各因素之間的相互作用進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)成功篩選出了4株菌，為后續(xù)的應(yīng)用研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Isolation and identification of cellulase－producing fungus and the effects on the cellulase production

LI Yi－ran;MA Kang
(Department of Life Science，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，China)

Four cellulase－ producing fungus were screened from soil and rotten wood sample．They were identified as T．viride persex－MF4，Penillium －MF4，Trichoderma koningii－TF3，Aspergillus niger－TF9．The influence factors on the cellulase－producing by the TF3 were studied．The results indicated that the optimum conditions of producing cellulase were as follows:carbon source was bran and micro－cellulose complex，nitrogen source was ammonium sulfate，culture temperature was 30－32℃，initial pH was 6—7．

Screen;identification;cellulase;influence factors

Q939.9

A

1671－7406(2011)09－0075－06

2011－05－11

李毅然 (1980—)，男，河南商丘人，商丘師范學(xué)院，碩士，助教。研究方向:環(huán)境微生物。

(責(zé)任編輯 徐成東)