朱淑云 董 英 張海暉 李希晶

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,鎮(zhèn)江 212013)

水飛薊粕蛋白的酶解及其酶解物抗氧化活性研究

朱淑云 董 英 張海暉 李希晶

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,鎮(zhèn)江 212013)

以水飛薊粕為原料,研究其蛋白酶解工藝及酶解物的抗氧化活性。結(jié)果表明,中性蛋白酶用于制備水飛薊粕蛋白抗氧化肽具有明顯的優(yōu)勢(shì)。正交試驗(yàn)確定了制備水飛薊粕蛋白抗氧化肽的最佳酶解條件為:底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2%,加酶量 14 000 U/g,pH 7.0,溫度 55℃,酶解時(shí)間 120 min,該條件下制備的水飛薊粕蛋白酶解物對(duì)羥自由基的清除率為 88.57%。抗氧化試驗(yàn)顯示,水飛薊粕蛋白酶解物具有一定的清除 DPPH自由基和羥自由基能力,IC50分別為 0.402 g/L和 6.659 g/L,水飛薊粕蛋白酶解物同樣也具有較強(qiáng)的還原能力。

水飛薊粕 蛋白酶 酶解工藝 抗氧化

研究證明,自由基的氧化損傷與許多疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)[1-3]。人體通過(guò)適當(dāng)攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)可以降低體內(nèi)自由基水平,防止脂質(zhì)過(guò)氧化,幫助機(jī)體抵御疾病[4-6]。生物活性肽是一類具有高度生物活性的物質(zhì),其抗氧化性顯著,它是蛋白質(zhì)經(jīng)特殊蛋白酶酶解或生物降解后產(chǎn)生的數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)氨基酸組成的肽類混合物,其結(jié)構(gòu)特殊,與氨基酸、大分子蛋白質(zhì)等物質(zhì)相比,具有極強(qiáng)的活性和多樣性,且食用安全性更高[7]。不同原料中的肽含量不同,尋找蛋白含量較高的天然產(chǎn)物來(lái)獲取活性較強(qiáng)抗氧化肽,引起了各國(guó)科學(xué)家的普遍關(guān)注。

水飛薊 (S ilibum m arianumGrertn)為菊科水飛薊屬一、二年生草本植物,原產(chǎn)于地中海沿岸,現(xiàn)廣泛分布于歐洲、北美洲、亞洲、非洲和南美洲,我國(guó)陜西、黑龍江、遼寧、江蘇、北京、湖北等地均有栽培,2004年我國(guó)水飛薊籽總產(chǎn)量 2萬(wàn)噸以上。近年來(lái)國(guó)內(nèi)對(duì)水飛薊資源的利用大都以提取水飛薊素為主,其副產(chǎn)品水飛薊粕一般用作飼料或肥料,利用的附加值較低。水飛薊粕中蛋白質(zhì)含量較高,氨基酸種類齊全,是一種潛力巨大的植物蛋白資源[8]。以植物蛋白為原料采用酶解方法制備生物活性肽已廣為應(yīng)用[9],目前有關(guān)酶解水飛薊粕蛋白制備抗氧化肽方面的研究卻鮮有報(bào)道。本研究以水飛薊粕為原料,以抗氧化能力為主要評(píng)價(jià)指標(biāo),通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化水飛薊粕蛋白的酶解條件,研究酶解物的抗氧化活性,為水飛薊蛋白資源的高值化利用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水飛薊種仁:江蘇中興藥業(yè)有限公司,經(jīng)過(guò)低溫加壓溶劑萃取技術(shù)脫脂,將脫脂水飛薊粕進(jìn)行粉碎過(guò) 80目篩,制得試驗(yàn)用水飛薊粕,經(jīng)測(cè)定其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 47.23%。中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶:無(wú)錫杰能科酶制劑公司;胰蛋白酶、木瓜蛋白酶:上海化學(xué)試劑公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

加壓溶劑萃取裝置:江南集團(tuán)與江蘇大學(xué)聯(lián)合研制;FC-160型錘式粉碎機(jī):上海中藥機(jī)械廠;WFJ7200可見光分光光度計(jì):尤尼柯 (上海)儀器有限公司;ALPHA I-4/2-4型冷凍干燥機(jī):德國(guó)CHR IST公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水飛薊粕蛋白酶解液的制備

按照水飛薊粕中的蛋白含量配制蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2%的懸浮液,40℃水浴浸泡 1 h,85℃水浴加熱變性處理 20 min,冷卻,調(diào)節(jié) pH和溫度,加入適量的蛋白酶進(jìn)行酶解。反應(yīng)過(guò)程中不斷加入 0.5 mol/L NaOH溶液,以保持反應(yīng)體系的 pH恒定。酶解結(jié)束后沸水浴 10 min滅酶,3 500 r/min離心 20 min,取上清液定容至適當(dāng)體積備用。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 蛋白酶的篩選

在各種酶的最適條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn),篩選出水解水飛薊粕蛋白所得的酸溶性肽得率和酶解物羥自由基清除率均最大的蛋白酶為最佳用酶。各蛋白酶的作用條件和活力見表 1。

表 1 蛋白酶的作用條件及活力

1.3.2.2 酶解條件優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,將底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為2%,選取加酶量、pH、酶解溫度和時(shí)間為 4個(gè)考察因素,對(duì)每個(gè)因素取 3個(gè)水平,進(jìn)行 L9(34)正交試驗(yàn),因素水平如表 2所示,以酶解物對(duì)羥自由基清除率為指標(biāo),對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

表 2 正交試驗(yàn)因素水平

1.3.3 酶解物酸溶性肽得率 (TCA-PSI)的測(cè)定

按文獻(xiàn) [10]的方法,取酶解液 4 mL,加入 10%TCA溶液 4 mL混合均勻,靜置 20 min,在 4 000 r/min下離心 20 min,用雙縮脲試劑測(cè)定上清液中的肽含量。每個(gè)樣品測(cè)定 3次,取均值。

肽得率(TCA-PSI)=酶解液中酸溶性肽含量/原料中蛋白質(zhì)含量 ×100%

1.3.4 酶解物抗氧化活性的測(cè)定

將在優(yōu)化條件下得到的水飛薊粕蛋白酶解上清液冷凍干燥,將粉末配成不同的濃度梯度進(jìn)行下列抗氧化試驗(yàn)。

1.3.4.1 清除 DPPH自由基能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11],將酶解物配成不同的濃度梯度后分別做為待測(cè)樣品備用。取 2 mL待測(cè)樣品于試管中,再加入 2 mL濃度為 0.04 g/L的 DPPH無(wú)水乙醇溶液,混合均勻,反應(yīng) 20 min,3 500 r/min離心分離 10 min,取上清液在 517 nm處測(cè)其吸光值為Ai;另取 2 mL待測(cè)樣品于試管中,分別加入無(wú)水乙醇2 mL,反應(yīng) 20 min,3 500 r/min離心分離 10 min,取上清液在 517 nm處測(cè)其吸光值為 Aj;以 2 mL 0.04 g/L DPPH無(wú)水乙醇溶液和 2 mL無(wú)水乙醇反應(yīng)做為參比,其吸光值記為 Ao。每個(gè)樣品測(cè)定 3次,取均值。按照下式計(jì)算待測(cè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除率 K:

K=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100%

同時(shí)配制不同濃度的維生素 C溶液,按上述方法測(cè)定維生素 C對(duì) DPPH自由基的清除率。

1.3.4.2 清除羥自由基 (·OH)能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12],將酶解物用蒸餾水配制成不同濃度梯度,各取 2mL酶解液,依次加入 2 mL 6mmol/L的 FeSO4、2 mL 6 mmol/L H2O2,混勻后靜置 10 min,再加入 2 mL 6 mmol/L水楊酸,混勻,靜置 30 min,在510 nm處測(cè)其吸光值記為 Ai′,當(dāng)用蒸餾水代替水楊酸時(shí)的吸光值記為 Aj′?？瞻讓?duì)照組以蒸餾水代替水飛薊粕酶解液,吸光值記為Ao′。每個(gè)樣品測(cè)定 3次,取均值。按照下式計(jì)算水飛薊粕蛋白酶解物對(duì)羥自由基 (·OH)的清除率 Y:

Y=[1-(Ai′-Aj′)/Ao′] ×100%

同時(shí)配制不同濃度的維生素 C溶液,按照上述方法測(cè)定維生素 C對(duì)羥自由基的清除率。

1.3.4.3 還原能力的測(cè)定:

參照文獻(xiàn)[12],將酶解物用蒸餾水配制成不同濃度梯度,在 2.5 mL pH6.6磷酸緩沖液中加入測(cè)試樣品 1 mL、1%鐵氰化鉀 1 mL,混合后于 50℃恒溫20 min,再加入 1 mL10%三氯乙酸,然后 3 000 r/min離心分離 10 min,取上層清液加蒸餾水 2.5 mL和0.1%FeCl30.5 mL,混合均勻,靜置 10 min后,在700 nm測(cè)定吸光值。每個(gè)樣品測(cè)定 3次,取均值。

同時(shí)配制不同濃度的維生素 C溶液,按照上述方法測(cè)定維生素 C的還原能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶的酶解效果

不同蛋白酶的底物特異性及作用位點(diǎn)不同,其酶解產(chǎn)物的功能性也將有所不同。本試驗(yàn)選用了 5種蛋白酶進(jìn)行酶解試驗(yàn),考查不同蛋白酶對(duì)酶解物TCA-PSI和·OH清除率的影響,以確定合適的蛋白酶,各種酶的酶解條件按表 1進(jìn)行,蛋白酶的加酶量均為 8 000 U/g,試驗(yàn)結(jié)果見表 3。

表 3 不同蛋白酶酶解物的·OH清除率和 TCA-PSI

由表 3可見,中性蛋白酶的·OH清除率和 TCA-PSI最高,其次是木瓜蛋白酶,風(fēng)味蛋白酶的·OH清除率最低,堿性蛋白酶的 TCA-PSI最低。綜合考慮,本試驗(yàn)將中性蛋白酶作為酶解水飛薊粕蛋白的最佳用酶。

2.2 水飛薊粕蛋白酶解條件的確定

選用中性蛋白酶,研究不同加酶量、溫度、pH和酶解時(shí)間對(duì)酶解物·OH清除率的影響,按照 1.3.2.2的方法優(yōu)化了水飛薊粕蛋白的酶解工藝條件。結(jié)果如表 4所示。

表 4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

從表 4中的極差 R分析可知,影響·OH清除率的酶解因素順序?yàn)?C>B>A>D,·OH清除率最高的組合為 A3B3C2D2,即加酶量 14 000 U/g,反應(yīng)溫度55℃,pH 7.0,時(shí)間 120 min。在此條件下進(jìn)行 3次驗(yàn)證試驗(yàn),水飛薊粕蛋白酶解物對(duì)·OH清除率平均值為 88.57%,比正交試驗(yàn)中各試驗(yàn)值都大,說(shuō)明得到的最優(yōu)組合是正確的。

2.3 水飛薊粕蛋白酶解物抗氧化試驗(yàn)效果

2.3.1 水飛薊粕蛋白酶解物清除DPPH自由基的效果分析

DPPH是一種有機(jī)自由基,DPPH自由基清除率目前被作為評(píng)價(jià)物質(zhì)是否具有抗氧化能力的指標(biāo)之一。由圖 1可見,隨著水飛薊粕蛋白酶解物和 VC質(zhì)量濃度的增大,其清除 DPPH自由基的能力呈增大的趨勢(shì),通過(guò)對(duì)它們質(zhì)量濃度與清除率之間進(jìn)行線性回歸,可以得到水飛薊粕蛋白酶解物的 IC50為0.402 g/L,VC的 IC50為 0.004 8 g/L,水飛薊粕蛋白酶解物的 I C50約為 VC的 83.75倍。盡管水飛薊粕蛋白酶解物清除DPPH自由基能力不如 VC強(qiáng),但遠(yuǎn)高于大米蛋白抗氧化肽[12],表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除 DP2 PH自由基的能力。

圖 1 水飛薊粕蛋白酶解物和VC對(duì)·DPPH的清除作用

2.3.2 水飛薊粕蛋白酶解物清除羥自由基 (·OH)的效果分析

圖 2 水飛薊粕蛋白酶解物和VC對(duì)·OH的清除作用

由圖 2可見,隨著水飛薊粕蛋白酶解物和 VC質(zhì)量濃度的增大,其對(duì)羥基自由基的清除能力呈增大的趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)它們質(zhì)量濃度與清除率之間進(jìn)行線性回歸,可以得到水飛薊粕蛋白酶解物的 IC50為6.659 g/L,VC的 IC50為 0.796 g/L。水飛薊粕蛋白酶解物的 IC50約為 VC的 8.37倍,其清除羥自由基的能力沒有 VC強(qiáng),但高于酪蛋白[13]、大豆[14]等酶解物對(duì)羥自由基的清除力,說(shuō)明作為一種天然原料,水飛薊粕蛋白酶解物已具有較強(qiáng)的清除羥自由基的能力。

2.3.3 水飛薊粕蛋白酶解物的還原能力分析

還原力與抗氧化活性存在相關(guān)性,還原力越強(qiáng),表明被測(cè)樣品的抗氧化性越好。而反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值越大,表明樣品的還原能力越強(qiáng)。從圖 3可見,隨著水飛薊粕蛋白酶解物和 VC質(zhì)量的增大,還原能力都進(jìn)一步增大,樣品質(zhì)量濃度和還原力之間呈顯著的量效關(guān)系,水飛薊粕蛋白酶解物還原力不如 VC強(qiáng),但與大米蛋白抗氧化肽[12]相比,其已表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力。

圖 3 水飛薊粕蛋白酶解物和VC的還原能力

3 結(jié)論

3.1 采用不同的蛋白酶水解水飛薊粕蛋白,通過(guò)測(cè)定其酸溶性肽得率和酶解物清除羥自由基的能力,確定了中性蛋白酶作為水解水飛薊粕蛋白的最佳用酶。

3.2 通過(guò)試驗(yàn)確定中性蛋白酶水解水飛薊粕蛋白的最佳酶解參數(shù)為:底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2%,加酶量14 000 U/g,酶解 pH 7.0,酶解溫度 55℃,時(shí)間 120 min,在此條件下,水飛薊粕蛋白酶解物對(duì)羥自由基清除率為 88.57%。

3.3 水飛薊粕蛋白酶解物的抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明,水飛薊粕蛋白酶解物清除 DPPH自由基和羥自由基的能力及其還原力雖不如 VC強(qiáng),但與其他天然原料的酶解物比較,其已表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。

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Enzymatic Hydrolysis ofMilk ThistleMeal Protein and Antioxidation of Hydrolysates

Zhu Shuyun Dong Ying Zhang Haihui Li Xijing
(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013)

The enzymatic hydrolysis technology ofmilk thistle meal protein and the antioxidation activity of the hydrolysateswere studied.Results show Neutrase is suitable to produce antioxidation active peptide from milk thistle meal protein.The opti mum conditions for the enzymatic hydrolysis were determined through orthogonal tests as fol2 lows:substrate concentration 2%,enzyme dose 14 000 U/g,pH 7.0,temperature 55℃,time 120 min.Under the op2 timum condition,the·OH scavenging rate is 88.57%.Moreover,the result of an antioxidation experiment shows that the milk thistle meal protein hydrolysates have very strong scavenging capabilities for·DPPH and·OH,and their I C50are 0.402 g/L and 6.659 g/L respectively,showing a very strong reducing ability aswell.

milk thistle meal,proteases,enzymolysis,antioxidation activity

TS209

A

1003-0174(2011)02-0068-05

江蘇大學(xué)高級(jí)人才科研啟動(dòng)基金(09JDG027)

2010-03-24

朱淑云,女,1975年出生,講師,博士,食品科學(xué)與工程