宋 艷，李建林，鄭鐵松

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇南京210097）

食源性致病菌PCR檢測中常用的靶基因及其參考引物

宋 艷，李建林，鄭鐵松*

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇南京210097）

PCR方法檢測食源性致病菌在敏感性、特異性與速度上都具有很大優(yōu)勢，在其應(yīng)用過程中，選擇的靶基因和由此設(shè)計(jì)的引物序列直接影響方法的特異性和靈敏性。綜述了大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌及其他常見的食源性致病菌在PCR檢測中常用的靶基因及其參考引物，以供相關(guān)研究者借鑒。

PCR，食源性致病菌，靶基因，引物

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。利用PCR方法對食品致病菌進(jìn)行檢測在敏感性、特異性與速度上都具有很大優(yōu)勢。隨著對一些主要食品微生物遺傳性質(zhì)了解的逐漸深入，許多致病菌的遺傳背景進(jìn)一步明了，PCR技術(shù)在食品檢測中也更加顯示出其應(yīng)用前景。PCR技術(shù)檢測食源性致病菌的特異性，取決于所選擇的擴(kuò)增靶序列是否為其待檢菌高度保守的特異性片斷。因此，選擇靶序列和由此設(shè)計(jì)的引物序列直接影響方法的特異性和靈敏性，隨著PCR技術(shù)在食源性致病菌中的廣泛應(yīng)用，對此也就提出了更高的要求。本文綜述了在食源性致病菌PCR檢測中常用的靶基因及其參考引物，以供相關(guān)實(shí)驗(yàn)工作者借鑒。

1 概述

1.1 PCR及引物

PCR（Polymerase Chain Reaction）是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，又稱為基因的體外擴(kuò)增法。PCR用到的引物是根據(jù)目標(biāo)細(xì)菌基因組DNA特異性保守序列（檢測靶點(diǎn)）而設(shè)計(jì)出來的寡核苷酸序列。PCR原理是首先將靶DNA雙鏈加熱變性為單鏈，加入兩段人工合成的引物；引物與互補(bǔ)的DNA單鏈堿基互補(bǔ)結(jié)合后，在有DNA聚合酶和4種dNTP底物存在的情況下，引物沿模板DNA鏈按5′→3′方向延伸，自動(dòng)合成新的DNA雙鏈。新合成的DNA雙鏈又可作為擴(kuò)增的模板，繼續(xù)重復(fù)以上的DNA多聚酶鏈反應(yīng)。經(jīng)過25～35次循環(huán)，可將靶DNA序列擴(kuò)增近百萬倍。因此檢測靶點(diǎn)與根據(jù)檢測靶點(diǎn)所設(shè)計(jì)的恰當(dāng)序列的引物，對于PCR檢測的準(zhǔn)確性和敏感程度來說是至關(guān)重要的。而且在近年的研究實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，檢測靶點(diǎn)的特異性不強(qiáng)是導(dǎo)致其PCR檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果的主要原因。

1.2 引物在PCR中的作用

引物對PCR擴(kuò)增的特異性起著關(guān)鍵的作用，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR擴(kuò)增的特異性和成功與否。靶序列的選擇是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵因素，選擇是否準(zhǔn)確則取決于對所檢測對象的遺傳背景的了解。引物序列則決定PCR產(chǎn)物的大小、位置、產(chǎn)量以及擴(kuò)增區(qū)域的Tm值和擴(kuò)增產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數(shù)。好的引物設(shè)計(jì)可以避免背景和非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生，得到的引物產(chǎn)量也可接近反應(yīng)指數(shù)期的產(chǎn)量理論值，而差的引物可能會很少產(chǎn)生目的產(chǎn)物甚至沒有，也可能會產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。顯然靶序列的選擇和引物的設(shè)計(jì)是PCR檢測實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。據(jù)目前研究報(bào)道來看，引物基本上是根據(jù)待檢測菌的一段已知序列設(shè)計(jì)的，并且大多數(shù)是根據(jù)屬特異靶序列設(shè)計(jì)的。

1.3 引物選擇設(shè)計(jì)的原則

PCR引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對合適的核苷酸片斷，使其能有效擴(kuò)增模板DNA。靶基因的選擇原則包括：各菌種（或?qū)伲┑臄U(kuò)增靶基因應(yīng)具有種屬特異性，即種（或?qū)伲┕灿校N（或?qū)伲╅g特異；各個(gè)靶基因應(yīng)沒有或有很小的同源性，因?yàn)榘谢蛴休^長同源序列的片段在退火時(shí)形成的非特異性互補(bǔ)會降低多重PCR擴(kuò)增效率。

引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：a.引物長度：特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。引物長度太短會降低序列的特異性；引物越長則擴(kuò)增退火時(shí)被引發(fā)的模板越少，而且錯(cuò)配的可能性也會增加。引物長度通常在20～25bp。b.引物與引物之間避免成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將導(dǎo)致引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間的競爭，從而影響擴(kuò)增成功。c.GC的合理含量和Tm值：Tm值在55～65℃，合理的GC含量一般為40%～60%。d.引物位點(diǎn)的選擇也很重要，對于同源性不高的基因來說，不同菌株內(nèi)的目的基因序列可能不同，所以要選取各基因序列的相同序列來設(shè)計(jì)引物。

2 檢測大腸桿菌的靶基因及其參考引物

2.1 大腸桿菌及其類型

大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道的正常菌群，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或其侵入腸外組織器官時(shí)，可作為條件致病菌而引起腸道外感染，食品衛(wèi)生學(xué)意義上的大腸桿菌嚴(yán)格稱為致病性大腸埃希菌，常被作為衛(wèi)生監(jiān)督的指示菌。致腹瀉大腸桿菌其致病機(jī)制幾乎均與毒力島基因或獲得性質(zhì)粒有關(guān)［1］，基因和質(zhì)粒攜帶的基因可編碼產(chǎn)生毒素和致病因子。按其產(chǎn)生特異性毒力因子的能力以及引起腹瀉的類型等可分為四類：腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒素大腸桿菌、腸侵染性大腸桿菌，此外還有腸聚集性大腸桿菌和彌散粘附性大腸桿菌。

2.2 檢測常用靶基因

2.2.1 rfbE rfbE是編碼大腸桿菌O157∶H7菌體抗原特異合成酶，并參與O抗原脂多糖的生物合成的基因，與Stx、eae、hlyA等其它毒力基因相比，rfbE特異性更強(qiáng)。所有的O157∶H7產(chǎn)毒或不產(chǎn)毒株，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后此片段都可擴(kuò)出，其他非O157∶H7株都為陰性，有較好的特異性［2］。

2.2.2 Stx Stx是EHEC的志賀樣毒素基因。此基因也被作為檢測大腸埃希菌O157∶H7的靶基因，是因?yàn)榻^大多數(shù)的大腸埃希菌O157∶H7菌株都具有志賀樣毒素基因。此基因可以檢測所有的產(chǎn)志賀毒素的菌株，而不產(chǎn)生志賀毒素的大腸埃希菌如腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌和腸侵襲性大腸埃希菌均不能擴(kuò)增出相應(yīng)的PCR產(chǎn)物［4］。

2.2.3 fliC fliC是H7鞭毛抗原基因，所有O157∶H7的產(chǎn)毒或不產(chǎn)毒株都能擴(kuò)出此段序列，其他非O157∶H7株均為陰性。若利用rfbE基因、fliC基因和Stx，設(shè)計(jì)3對引物，在檢測其血清分型的同時(shí)，也可以檢測菌株能否產(chǎn)生高致病性的志賀毒素，在食品安全的監(jiān)測與控制方面會具有更重要的意義。

2.2.4 per per是編碼糖胺合成酶（perosamine synthetase，per）的序列。糖胺合成酶是大腸桿菌O157∶H7型合成O型抗原的重要因素，一旦其基因發(fā)生變異就能使大腸桿菌O157∶H7的O型抗原合成中斷。該基因可以特異性擴(kuò)增大腸桿菌O157∶H7型。

2.2.5 hlyA hlyA是EHEC的溶血素基因，位于一個(gè)60MD的大質(zhì)粒上，而幾乎所有的O157∶H7菌株都有一個(gè)這樣的質(zhì)粒。通過對hly的PCR檢測，除常見的O157∶H7血清型外，也可檢出其他血清型大腸埃希菌。

常用到的檢測靶基因及參考引物見表1。

表1 檢測大腸桿菌的靶基因及其參考引物［3-6］

3 沙門氏菌常用的靶基因及參考引物

在食物中毒中沙門氏菌屬是最常見的致病菌，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗(yàn)檢疫中有著十分重要的意義，常污染各種肉、魚、蛋、乳類食品而引起食物中毒，其中以肉類占多數(shù)。沙門氏菌抗原構(gòu)造包括菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原和Vi抗原，分型主要依靠O、H抗原。用來設(shè)計(jì)PCR引物的基因（見表2）主要分三類，即屬特異性基因、血清群特異性基因和血清型特異性基因。

3.1 inv

inv基因序列是一組基因，包括invA、invB、invC、invD、invE等，它編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白。其中invA是編碼沙門氏菌的侵襲蛋白的基因，侵襲基因使細(xì)菌具有侵襲宿主上皮細(xì)胞的能力，只存在于致病性沙門菌中的獨(dú)特的保守基因序列，invA基因也是毒力島SP11基因之一，沙門菌的粘附和穿入宿主細(xì)胞就是由其介導(dǎo)的。Rahn等［7］根據(jù)invA基因設(shè)計(jì)引物，PCR檢測沙門氏菌均得到特異擴(kuò)增片斷，而非沙門氏菌則無特異擴(kuò)增。

3.2 傷寒沙門菌鞭毛抗原（sef）

鞭毛是細(xì)菌重要的毒力因子之一，它為細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)提供動(dòng)力，可以作為在細(xì)胞表面的黏附素，決定了細(xì)菌在細(xì)胞表面吸附及以后的侵入和定居過程?？梢杂胹efA基因（編碼鞭毛的抗原）設(shè)計(jì)引物用PCR方法檢出沙門菌，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)內(nèi)、外引物進(jìn)行套式PCR，特異擴(kuò)增出傷寒沙門氏菌，而包括副傷寒沙門氏菌在內(nèi)的其他沙門氏菌，以及非沙門氏菌屬的其他細(xì)菌都無法擴(kuò)增。Soumet等根據(jù)沙門菌屬隨機(jī)克隆序列、傷寒沙門菌的fliC基因和腸炎沙門菌的sefA基因設(shè)計(jì)了三對引物，應(yīng)用多重PCR結(jié)果可特異性檢出傷寒沙門菌和腸炎沙門菌，敏感性可達(dá)95%［8］。

表2 沙門氏菌常用的靶基因及參考引物［11-15］

3.3 ViaB

致病的傷寒沙門菌都具有Vi抗原，Vi多糖抗原為N-乙酰半乳糖胺糖醛酸多聚物，Vi抗原產(chǎn)物由染色體中ViaA和ViaB兩組基因所控制，其中ViaB基因被認(rèn)為是Vi抗原表達(dá)的特異結(jié)構(gòu)基因。

正在我糾結(jié)的時(shí)候，兩邊的比賽火熱地進(jìn)行。沈宜修端莊大方，她的幾個(gè)女兒都是一等一的美人，陳圓圓欲語還休，猶抱琵琶半遮面雙眼如迷霧般朦朧，柳如是一身男裝打扮清爽利落粉雕玉琢，一時(shí)間覺得滿屋光華照人，看得我驚呆了。在這個(gè)緊要關(guān)頭，我不能亂了陣腳，趕緊先找到男主角再說。我的目光在人群里搜索，看得出來，和我一樣眼神飄忽的女子還不少，難道都在找楊公子？

除此以外，主要編碼菌毛亞單元的fimA、沙門氏菌侵襲基因正調(diào)節(jié)蛋白hilA、質(zhì)粒毒力相關(guān)的SPV基因、編碼組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子hut基因、沙門菌外膜蛋白基因ompC、腸毒素基因stn基因、質(zhì)粒編碼菌毛的pef基因、染色體復(fù)制起點(diǎn)的DNA序列、16S～23S rDNA之間的區(qū)域也常被作為沙門氏菌PCR檢測靶點(diǎn)Yeh等人［9］則提出，利用fimY基因進(jìn)行檢測具有很好的特異性，使運(yùn)動(dòng)性和非運(yùn)動(dòng)性的沙門氏菌都能得到擴(kuò)增。Lim等根據(jù)編碼O4抗原的rfbJ基因、編碼H：i抗原的fliC基因和編碼H：1，2抗原的fljB基因設(shè)計(jì)三對引物對鼠傷寒沙門菌進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增［10］。

4 金黃色葡萄球菌檢測常用的靶基因

金黃色葡萄球菌是一群常堆積成葡萄串狀革蘭氏陽性球菌。金黃色葡萄球菌引起的食物中毒主要是由其在繁殖過程中分泌到菌體細(xì)胞外的腸毒素引起的，其食物中毒常發(fā)生在春秋季節(jié)。引起食物中毒的食品，主要為肉、奶、魚、蛋類及其制品等動(dòng)物性食品為主。

4.1 nuc

nuc是編碼金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因。目前認(rèn)為金黃色葡萄球菌的熱穩(wěn)定性核酸酶由葡萄球菌核酸酶編碼其產(chǎn)物是耐熱核酸酶。為Ramesh采用多重PCR通過擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的nuc和ail基因，可以將其從牛奶中檢測出來［16］。

4.2 sea seb sec sed see

sea seb sec sed see是其編碼腸毒素的基因［17］，腸毒素可分為A、B、C、D、E及H6種血清型，是食物中毒導(dǎo)致急性胃腸炎的主要因素。有1/3金黃色葡萄球菌產(chǎn)生此蛋白質(zhì)性毒素。

4.3 Coa

金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，它是一種能使含有枸椽酸鈉或肝素抗凝劑的人或兔血漿發(fā)生凝固的酶類物質(zhì)，致病菌株多能產(chǎn)生此類物質(zhì)，常作為鑒別葡萄球菌有無致病性的重要標(biāo)志［18］。

其他如能增強(qiáng)金黃色葡萄球菌的耐藥性的輔助基因femA，金黃色葡萄球菌編碼表皮剝脫毒素表皮剝落毒素eta etb也常用到，見表3。

表3 金黃色葡萄球菌檢測常用的靶基因及參考引物［18-23］

5 志賀氏菌檢測常用的靶基因及引物

志賀菌屬是主要的腸道病原菌之一，屬革蘭氏陰性桿菌，是人類細(xì)菌性痢疾最常見的病原菌，通稱痢疾桿菌。志賀氏菌作為侵襲性病原菌，其致病性主要由毒力質(zhì)粒所介導(dǎo)。它主要的致病因素有：侵襲力、內(nèi)毒素和Vero毒素。

志賀菌的致病性主要與其毒力基因的表達(dá)產(chǎn)物相關(guān)，其中福氏志賀氏菌的侵襲性質(zhì)粒抗原H的基因ipaH、編碼侵襲性質(zhì)?；騣al、志賀菌腸毒素1基因ShET-1和志賀菌腸毒素2基因ShET-2是已確定的一組與疾病相關(guān)的致病基因。馬宏等［24］人建立了同時(shí)檢測ShET-1B、ShET-2、ipaH和ial4種毒力基因的多重PCR檢測方法。經(jīng)對624株志賀菌毒力基因的鑒定，認(rèn)為該方法具有靈敏、特異、穩(wěn)定的特點(diǎn)。

此外，志賀氏菌中acrAB的表達(dá)受多種調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)，最主要的為AcrR抑制子與耐多藥（mar）操縱子。通過PCR檢測調(diào)控基因acrR、marOR的突變與志賀菌耐多藥之間的關(guān)系，為防治志賀菌耐多藥產(chǎn)生提供依據(jù)［25］，也可以作為志賀氏菌的靶基因。

表4 志賀氏菌檢測常用的靶基因及參考引物［12，26-27］

6 其他食源性致病菌PCR引物設(shè)計(jì)中用到的目的基因及其參考引物

見表5。

6.1 單核細(xì)胞增生性李斯特菌

單核細(xì)胞增生性李斯特菌是一種重要的人獸共患和食品衛(wèi)生病原菌，該菌主要通過肉乳及其制品引起人的感染發(fā)病，能引起人和動(dòng)物腦膜炎，敗血癥及孕婦流產(chǎn)等。hly編碼溶血素O的基因，溶血素為李斯特菌的主要致病因子，由hly基因編碼。hly基因在李斯特菌中是保守的片段。Inl是李斯特菌的內(nèi)化基因，內(nèi)化素是李斯特菌的表面蛋白，是侵襲性蛋白，能與上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞等多種真核細(xì)胞結(jié)合，繼而進(jìn)入寄居細(xì)胞。Almeida則以Lm的inl作為靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該基因是Lm所特有的基因片段，其他的李斯特菌則不具這個(gè)基因片段，同時(shí)選取了金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌作對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性［28］。此外，編碼一種侵襲性蛋白P60的基因iap，也具有李斯特種屬特異性，相對保守高度特異［29］。

6.2 霍亂弧菌

霍亂弧菌是人類霍亂的病原體，在出入境的食品中也不允許被檢出。霍亂弧菌的致病因素主要包括毒素和定居因子，主要毒素有霍亂腸毒素、小帶聯(lián)結(jié)毒素、副霍亂毒素。檢測霍亂弧菌的常用的靶基因主要有編碼霍亂腸毒素的CTX基因、毒力調(diào)節(jié)基因toxR、調(diào)控編碼cT和TCP的基因、編碼外膜蛋白的ompW基因、毒素協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛編碼基因TcpA、編碼小帶聯(lián)結(jié)毒素的基因、Zot及編碼TCP菌毛的TCP基因等。

6.3 副溶血弧菌

副溶血性弧菌是一種嗜鹽性弧菌，常呈多形態(tài)性，有鞭毛，無莢膜和芽孢，常存在于海產(chǎn)品及鹽漬食品中。目前認(rèn)為副溶血弧菌的致病因子主要有三種，分別為不耐熱溶血毒素TLH、耐熱直接溶血毒素TDH和相對耐熱直接溶血毒素TRH［31］。位于染色體上編碼TLH的基因據(jù)推測是副溶血弧菌的特異性基因，還有編碼副溶血弧菌ToxR蛋白的基因及其開放閱讀框序列ORF。Bej等人根據(jù)副溶血性弧菌編碼不耐熱溶血素的tlh基因、耐熱直接溶血素的tdh基因和相對耐熱直接溶血素的trh基因設(shè)計(jì)引物，利用多重PCR檢測111份樣品中的副溶血性弧菌，其敏感性高，特異性強(qiáng)，而且能區(qū)分產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株，遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法［32］。

6.4 化膿鏈球菌

通過分析化膿鏈球菌編碼M抗原蛋白emm基因的高變區(qū)5′末端序列，PCR技術(shù)以及基于核酸序列分析方法突破了傳統(tǒng)M分型系統(tǒng)的限制。對于化膿鏈球菌具有種特異性的基因還有Smez及目的基因?yàn)镾pyl258轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列［34］。

7 結(jié)語

引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否，是PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個(gè)關(guān)鍵。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，各種微生物的基因序列的逐漸明了，使得引物設(shè)計(jì)有了更多選擇。例如近年發(fā)現(xiàn)由于轉(zhuǎn)錄調(diào)控子代表了細(xì)菌在適應(yīng)環(huán)境和進(jìn)化過程中的關(guān)鍵分子成分，因此，轉(zhuǎn)錄調(diào)控子序列很有可能具有種特異性和群特異性。有學(xué)者選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)控子序作為目的序列，建立能特異性地檢測包括化膿鏈球、無害李斯特氏菌、單核增生李斯特菌、出血敗血性巴斯德氏菌以及金黃色葡萄球菌在內(nèi)的多種細(xì)菌的PCR檢測方法。近年來對食品病原細(xì)菌致病機(jī)理的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)許多與致病相關(guān)的基因，這些基因大多都是該菌所特有的，此外一些編碼獨(dú)特酶或其他代謝產(chǎn)物的基因也高度保守。隨著這些新的保守基因的發(fā)現(xiàn)和研究，PCR檢測病原細(xì)菌的靶基因會有更多選擇，必將推動(dòng)這一檢測技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。

表5 其他食源性致病菌PCR引物設(shè)計(jì)中用到的目的靶基因及參考引物［12-13，15，29-31，33-35］

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Molecular targets and primers-associated for the PCR detection of foodborne pathogen

SONG Yan，LI Jian-lin，ZHENG Tie-song*
（Jinling College，Nanjing Normal University，Nanjing 210097，China）

The PCR detection of foodborne pathogen is rapid，accurate，specific and sensitive.Molecular targets and primers-associated could effect the specification and sensitivity of PCR detection directly.The paper reviewed the studies on the molecular targets and primers-associated for the PCR detection of Escherichia coli，Salmonella，Staphylococcus aureus，Shigella and other foodborne pathogen，which would be a great pool of information resources to select specific targets for the PCR detection.

PCR；foodborne pathogen；molecular target；primers

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0371-06

2009-12-08 *通訊聯(lián)系人

宋艷（1984-），女，在讀碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)及食品安全方面的研究。