張小永，羅愛(ài)平，唐會(huì)周

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

牛肉預(yù)煮液作為培養(yǎng)基氮源的可能性探討

張小永，羅愛(ài)平*，唐會(huì)周

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

牛肉預(yù)煮液進(jìn)行離心、過(guò)濾等預(yù)處理后，將其濃縮至原體積的75%、50%，主要測(cè)定總氮、氨基酸態(tài)氮含量。以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌為質(zhì)控菌株，檢驗(yàn)三種不同濃度牛肉預(yù)煮液替代普通肉湯的靈敏度，并觀察三種質(zhì)控菌株分別在不同濃度牛肉預(yù)煮液配制的營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)。結(jié)果表明：原液、濃縮至原體積75%、50%濃縮液總氮含量分別為2.044、3.066、4.088mg/mL，氨基酸態(tài)氮含量分別為0.945、1.425、1.890mg/mL；磷酸鹽實(shí)驗(yàn)、堿性沉淀實(shí)驗(yàn)、色素生成實(shí)驗(yàn)以及靈敏度均符合培養(yǎng)基要求。三種質(zhì)控菌株的菌落形態(tài)、菌落大小、色素生成均符合菌株的生長(zhǎng)特性，在50%的濃縮液牛肉預(yù)煮液配制的營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)24h，靈敏度均能達(dá)到10-9，敏感性最強(qiáng)，故可將總氮、氨基酸態(tài)氮含量分別達(dá)4.088、1.890mg/mL的濃縮液替代用于此三種質(zhì)控菌株培養(yǎng)的牛肉浸液。

牛肉預(yù)煮液，總氮，培養(yǎng)基，牛肉浸液

預(yù)煮是牛肉深加工中重要的工藝環(huán)節(jié)之一［1］，預(yù)煮后所剩的湯汁即為牛肉預(yù)煮液。牛肉預(yù)煮液中含氮物質(zhì)豐富，包括游離氨基酸、二肽、尿素、胍的衍生物、嘌呤堿等［2］，是一類可再利用的氮源。牛肉浸液是動(dòng)物組織浸液中最古典的培養(yǎng)基成分，由切除脂肪、筋腱、肌膜的牛肉絞碎，煮制過(guò)濾而得［3］。它是培養(yǎng)基基礎(chǔ)液，廣泛用于配制營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、半固體等培養(yǎng)基，主要為微生物生長(zhǎng)繁殖提供可溶性含氮物、核酸降解物、維生素及無(wú)機(jī)鹽等，以補(bǔ)充蛋白胨營(yíng)養(yǎng)成分的不足。牛肉預(yù)煮液是牛肉制品生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物，在生產(chǎn)過(guò)程中作為廢棄物排放，不僅導(dǎo)致污染環(huán)境，而且是一種資源的浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)擬探討牛肉預(yù)煮液替代牛肉浸液作為微生物培養(yǎng)基有機(jī)氮源的可能性，旨在為牛肉預(yù)煮液的綜合利用尋求一條途徑，為現(xiàn)代生物技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要基礎(chǔ)性材料尋求質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的原材料。

表1 麥?zhǔn)媳葷峁芘渲票?/p>

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌 貴州大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全系微生物實(shí)驗(yàn)室提供；牛肉預(yù)煮液 貴州永紅食品有限公司提供，預(yù)煮的牛肉與水質(zhì)量比（m/m）為1∶1；瓊脂 杭州微生物試劑有限公司；牛肉膏 上?？禎?rùn)生物科技有限公司。

CD4-2低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；凱氏定氮儀 上海昕瑞儀器儀表有限公司；LDZM-50立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司；HI208臺(tái)式pH測(cè)定儀 北京哈納科儀科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛肉預(yù)煮液預(yù)處理

1.2.1.1 工藝流程 牛肉預(yù)煮液→粗濾→精濾→離心→濃縮

1.2.1.2 操作要點(diǎn) 粗濾：牛肉預(yù)煮液在10～15℃條件下靜置，使脂肪凝固，便于過(guò)濾，用四層紗布過(guò)濾。精濾：取濾液進(jìn)一步用濾紙過(guò)濾。離心：將精濾處理的牛肉預(yù)煮液3500r/min離心30min，濾液備用。濃縮：離心處理的牛肉預(yù)煮液在55℃，真空度0.02MPa條件下濃縮，濃縮至原體積的75%、50%，121℃、30min高壓滅菌，置4℃下保存?zhèn)溆?。原液、濃縮至原體積75%、50%濃縮液以下分別簡(jiǎn)稱1、2、3號(hào)液。

1.2.1.3 麥?zhǔn)媳葷峁艿闹谱骷笆褂?分別配制1%硫酸溶液及1%氯化鋇溶液，取口徑相等質(zhì)地相同的試管10支，按表1所示分別將硫酸及氯化鋇溶液加入，封固管口，注明號(hào)碼備用。

將0.9%（w/v）NaCl無(wú)菌生理鹽水洗下的三種質(zhì)控菌株分別加入與標(biāo)準(zhǔn)管大小相同的無(wú)菌試管中。被測(cè)定試管加入0.9%（w/v）NaCl無(wú)菌生理鹽水，直至濃度與所要求的標(biāo)準(zhǔn)管濃度相同。與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相比較，視其濁度相當(dāng)于比濁管的第幾管，然后將比濁管相當(dāng)菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即可得到每毫升中所含細(xì)菌的數(shù)量。如細(xì)菌原液1∶5稀釋后其濁度與第3管相當(dāng)，則原液每毫升含菌數(shù)為9×5=45億。

菌液的稀釋按下列公式計(jì)算：

如原液5mL，每毫升含菌45億，今欲稀釋為每毫升含菌10億的溶液，應(yīng)加無(wú)菌生理鹽水的毫升數(shù)為：（5×45）/（10-5）=17.5mL，即細(xì)菌原液5mL加生理鹽水17.5mL稀釋即成。

1.2.2 牛肉預(yù)煮液理化指標(biāo)測(cè)定

1.2.2.1 總氮含量測(cè)定 凱氏定氮法，按 GB/T 9695.11-2008。

1.2.2.2 氨基酸態(tài)氮測(cè)定 雙指示劑甲醛滴定法，按GB/T 5009.39-2003。

1.2.2.3 還原糖測(cè)定 高錳酸鉀滴定法，按 GB/T 5009.7-2008。

1.2.2.4 pH測(cè)定 HI208臺(tái)式pH測(cè)定儀測(cè)定。

1.2.2.5 顏色、澄明度和沉淀 分別取1、2、3號(hào)液各50mL加熱煮沸，冷卻后直接觀察溶液的顏色、澄明度和沉淀［3］。

1.2.2.6 堿性沉淀 分別取1、2、3號(hào)液各100mL，置于250mL三角瓶中，用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)pH8～9，121℃、30min高壓滅菌，冷卻后直接觀察澄明度和沉淀［3］。

1.2.2.7 磷酸鹽沉淀 分別取1、2、3號(hào)液100mL、磷酸二氫鉀0.5g，置于250mL三角瓶中，用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)pH7.4～7.6，121℃、30min高壓滅菌，冷卻后直接觀察澄明度和沉淀［3］。

1.2.3 菌種活化 制備營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌三種質(zhì)控菌種逐代培養(yǎng)至第3代（F3），保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 靈敏度測(cè)定［4-5］采用3次3管法，分別測(cè)定1、2、3號(hào)液替代營(yíng)養(yǎng)肉湯的靈敏度。取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌第3代（F3）培養(yǎng)菌株，用0.9%（w/v）NaCl無(wú)菌生理鹽水制成均勻菌液，此菌液濃度相當(dāng)于麥?zhǔn)媳葷峁艿?0管濃度。將此濃度菌液用生理鹽水分別進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9五個(gè)稀釋度分別接種1mL于三種濃度牛肉預(yù)煮液濾液9mL小管，各3管，同時(shí)各取3個(gè)試管不接種菌懸液作陰性對(duì)照。37℃培養(yǎng)3d，逐日觀察結(jié)果。

1.2.5 色素生成測(cè)定 取三種質(zhì)控菌菌懸液0.1mL，分別接種于1、2、3號(hào)液制成的三種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿內(nèi)，用L型玻棒涂勻，37℃培養(yǎng)24h。同時(shí)各取3個(gè)平皿不接種菌懸液作陰性對(duì)照。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂配制：牛肉預(yù)煮液原液、濃縮至原體積75%、50%濃縮液各1000mL；氯化鈉，5g；瓊脂，15g；pH7.2～7.6。

1.2.6 菌落形態(tài)觀察 同色素生成測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

1、2、3號(hào)液理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 牛肉預(yù)煮液理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表3 三種不同濃度牛肉預(yù)煮液替代營(yíng)養(yǎng)肉湯的靈敏度

如表2所示，1、2、3號(hào)液，總氮含量分別為2.044、3.066、4.088mg/mL，氨基酸態(tài)氮含量分別為0.945、1.425、1.890mg/mL；均為澄清，微黃；沉淀、磷酸鹽沉淀及堿性沉淀在實(shí)驗(yàn)中均無(wú)。據(jù)薛麗華等報(bào)道［4］，華安牛肉浸液中總氮含量為3.68mg/mL。結(jié)果表明：濃縮牛肉預(yù)煮液可達(dá)到普通牛肉浸液水平，可將濃縮至原體積50%即總氮含量達(dá)4.088mg/mL、氨基酸態(tài)氮含量達(dá)1.890mg/mL的牛肉預(yù)煮液作為傳統(tǒng)牛肉浸液的替代品。

2.2 靈敏度

靈敏度是培養(yǎng)基質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，是指一種培養(yǎng)基對(duì)某一種微生物在該培養(yǎng)基中能得以良好生長(zhǎng)的最低接種量。如表3所示，1號(hào)液接種金黃色葡萄球菌，37℃培養(yǎng)24h后靈敏度達(dá)10-8，培養(yǎng)48h后靈敏度達(dá)10-9；接種大腸桿菌，37℃培養(yǎng)24h后靈敏度達(dá)10-8，但不及接種金黃色葡萄球菌敏感，3管檢驗(yàn)管中僅有2管呈陽(yáng)性，在培養(yǎng)48h后靈敏度達(dá)10-9；接種沙門氏菌，37℃培養(yǎng)24h后靈敏度達(dá)10-8，培養(yǎng)48h后靈敏度仍為10-8，培養(yǎng)72h后靈敏度達(dá)10-9。

2號(hào)液接種金黃色葡萄球菌，37℃培養(yǎng)24h后靈敏度10-9；接種大腸桿菌，37℃培養(yǎng)24h后靈敏度達(dá)10-8，培養(yǎng)48h后靈敏度達(dá)10-9，但不及接種金黃色葡萄球菌敏感，3管檢驗(yàn)管中僅有2管呈陽(yáng)性；接種沙門氏菌，37℃培養(yǎng)24h后靈敏度達(dá)10-9。

3號(hào)液接種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌37℃培養(yǎng)24h后靈敏度均達(dá)到10-9，金黃色葡萄球菌最為敏感，3管檢驗(yàn)管均呈陽(yáng)性；大腸桿菌與沙門氏菌3管檢驗(yàn)管中僅有2管呈陽(yáng)性。

不同濃度牛肉預(yù)煮液的靈敏度實(shí)驗(yàn)表明，靈敏度隨含氮量提高而增強(qiáng)，即1號(hào)＜2號(hào)＜3號(hào)。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌在3號(hào)液替代營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)情況均較好。金黃色葡萄球菌在3號(hào)液中形成較多懸浮菌；大腸桿菌在3號(hào)液中生長(zhǎng)形成菌膜，中部生成懸浮菌；沙門氏菌在3號(hào)液表面生成菌膜，中部有懸浮菌。

2.3 色素生成實(shí)驗(yàn)與菌落形態(tài)觀察

色素生成實(shí)驗(yàn)反映了某種菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)是否符合其本質(zhì)特性。如表4所示，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌分別接種到1、2、3號(hào)液配制的三種營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后，菌落形態(tài)均呈S型；金黃色葡萄球菌菌落直徑D為1.4～1.6mm，大腸桿菌菌落為2.0～2.3mm，沙門氏菌菌落為1.6～1.8mm。除金黃色葡萄球菌有金黃色色素生成外，其余2種菌株均無(wú)色素生成。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的生長(zhǎng)情況，均符合該菌株的生長(zhǎng)特性［6-7］。

表4 三種質(zhì)控菌株的菌落形態(tài)和色素生成結(jié)果

綜上所述，原液、濃縮至原體積75%、50%濃縮液的磷酸鹽實(shí)驗(yàn)、堿性沉淀實(shí)驗(yàn)、色素生成實(shí)驗(yàn)和菌落觀察，以及靈敏度結(jié)果均符合培養(yǎng)基要求［8-9］。

3 結(jié)論與討論

3.1 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌是食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中常規(guī)的檢測(cè)指標(biāo)，是保障食品質(zhì)量安全的控制指標(biāo)，故本實(shí)驗(yàn)選用此三種菌株探討牛肉預(yù)煮液作為培養(yǎng)基氮源的可能性。

3.2 牛肉浸液是以牛肉為原料而制成，成本較高。牛肉預(yù)煮液在牛肉制品生產(chǎn)過(guò)程中作為廢棄物排放，但經(jīng)離心、過(guò)濾等簡(jiǎn)單處理即可變廢為寶，作為微生物培養(yǎng)基氮源。結(jié)果表明：原液、濃縮至原體積75%、50%濃縮液的磷酸鹽實(shí)驗(yàn)、堿性沉淀實(shí)驗(yàn)、色素生成實(shí)驗(yàn)和菌落觀察，以及靈敏度結(jié)果均符合培養(yǎng)基要求。

3.3 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌在50%的濃縮液替代的營(yíng)養(yǎng)肉湯中靈敏度達(dá)到10-9，敏感性最強(qiáng)；菌落形態(tài)、菌落大小、色素生成均符合菌株的生長(zhǎng)特性。故可將經(jīng)預(yù)處理的牛肉預(yù)煮液濃縮，使其總氮含量達(dá)4.088mg/mL、氨基酸態(tài)氮含量達(dá)1.890mg/mL，替代用于培養(yǎng)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌三種質(zhì)控菌株的傳統(tǒng)牛肉浸液，但能否作為其他微生物生長(zhǎng)繁殖的氮源還有待進(jìn)一步研究。

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Study on the possibility of pre-cooked beef fluid nitrogen as a medium to explore

ZHANG Xiao-yong，LUO Ai-ping*，TANG Hui-zhou
（College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Pre-cooked beef liquid to centrifugation and filtration etc，was concentrated to the original volume of its 75%，50%，mainly determination of total nitrogen，amino nitrogen content.Staphylococcus aureus，E.coli，Salmonella strains for quality control，testing of three different concentrations of pre-cooked beef broth liquid alternative to ordinary sensitivity，and to observe the three kinds of quality control strains were pre-cooked beef at different concentrations of nutrient agar solution prepared on the growth of colony morphology.The results showed that：the original pre-cooked beef liquid，concentrated to the original volume of 75%，50%concentrated liquid TN contents were 2.044，3.066，4.088mg/mL，amino acid nitrogen contents were 0.945，1.425，1.890mg/mL.Phosphate test，alkaline precipitation test，pigment-producing testing and sensitivity met the media requirements.Three kinds of quality control strains of colony morphology，colony size，pigment-producing strains were in line with the growth characteristics.Concentrated solution in 50%of the pre-cooked beef liquid nutrient broth prepared to cultivate 24h sensitivity can reach 10-9，the sensitivity of the strongest.Therefore TN，amino nitrogen content were up to 4.088，1.890mg/mL can be alternative to the concentrated solution of three quality control strains used for this culture of beef extract.

pre-cooked beef fluid；total nitrogen；culture media；beef immersion

TS251.9

A

1002-0306（2011）01-0172-04

2010-02-01 *通訊聯(lián)系人

張小永（1982-），在讀碩士，研究方向：藥食資源利用。