馬燕燕，魯曉翔

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津300134）

AB-8樹脂純化柿葉總黃酮的工藝研究

馬燕燕，魯曉翔*

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津300134）

目的：篩選出分離純化柿葉總黃酮的最佳樹脂，并對影響分離純化的因素進行研究，得到優(yōu)化的純化條件。方法：選用AB-8、ADS-17和D3520三種型號大孔吸附樹脂，采用動態(tài)吸附-解吸方法，利用分光光度法測定黃酮含量，研究了不同的大孔吸附樹脂及其不同的工藝條件對柿葉黃酮分離純化的影響。結(jié)果：實驗表明AB-8樹脂的分離效果最好，其最佳工藝為：上柱液pH6，上柱液流速2BV/h，樣液濃度為3mg/mL，70%乙醇為洗脫液，洗脫液流速控制在2BV/h，洗脫液用量為3BV。在此條件純化后，柿葉黃酮提取物中黃酮含量由9%提高到34%。結(jié)論：AB-8大孔樹脂可以較好地分離純化柿葉黃酮。

柿葉，總黃酮，大孔吸附樹脂，分離純化

柿屬植物在我國大約有40余種，以柿最為常見，分布十分廣泛。柿葉［1-3］是柿的新鮮或干燥葉片，其味苦，具有止血、清熱解毒、抗癌等多種醫(yī)療保健功能。柿葉的主要有效成分是黃酮類化合物，目前已發(fā)現(xiàn)的柿葉黃酮類化合物有黃芪苷、楊梅樹皮苷、異槲皮素［4］、山萘酚、槲皮素、盧丁、金絲桃苷［5］。在我國，柿葉主要制成柿葉茶，但大多數(shù)柿葉卻被當(dāng)作廢物扔掉，所以提高柿葉的利用率是研究的一個目標(biāo)。大孔吸附樹脂是一類不溶于酸、堿及各種有機溶劑且有較好吸附性能的有機高聚物吸附劑，具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、吸附容量大、選擇性好、再生處理方便等諸多優(yōu)點，尤其適用于黃酮類化學(xué)物的分離純化［6-8］，近年來逐漸被應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分的分離純化。本實驗選擇三種樹脂（AB-8、ADS-17和D3520），進行對柿葉中黃酮的吸附與分離性能的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柿葉 采于天津薊縣，洗凈、干燥后粉碎成粉，過40目篩；蘆丁標(biāo)準品 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；AB-8、ADS-17、D3520型大孔樹脂 南開大學(xué)化工廠。

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；UV-1700紫外可見分光光度計、AUY120電子分析天平 島津；FD-1冷凍干燥機 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；CXG-1電腦恒溫層析柜 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理 樹脂預(yù)處理：樹脂使用前預(yù)處理可以除去其中所含的低聚物、有機物及有害離子。首先將大孔吸附樹脂浸泡在95%乙醇中24h，充分溶脹，用乙醇清洗至流出液加適量蒸餾水無混濁。再用蒸餾水洗盡乙醇，樹脂裝柱后，用5% HCl溶液以2BV/h流速酸洗，蒸餾水洗至中性；用5%NaOH溶液以2BV/h流速堿洗，用水沖洗至中性，樹脂備用。

1.2.2 樣品的制備方法 稱取一定量柿葉樣品，以70%乙醇做溶劑，按固液比1∶30加入70%乙醇，于50℃水浴器中提取2次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮，冷凍干燥。

1.2.3 大孔吸附樹脂對柿葉黃酮的靜態(tài)吸附和解吸實驗

1.2.3.1 靜態(tài)吸附和解吸實驗 取3份濃度為1mg/mL的樣品液各20mL裝入50mL三角瓶中，分別加入3種型號的樹脂各1g，室溫置于搖床上振蕩6h。將充分吸附后的樹脂過濾，置于50mL三角瓶中，再用70%的乙醇解吸，室溫置于搖床上振蕩6h，測定吸附前后樣液的黃酮濃度，選出吸附率和解吸率都好的樹脂；同時考察吸附溫度和吸附pH對靜態(tài)吸附的影響。按式（1）、式（2）計算樹脂吸附率和解吸率。

其中：A為吸附率（%）、B為解吸率（%）；C0為起始濃度、C1為平衡濃度、C2為解吸液濃度（mg/mL）；V1為吸附液體積、V2為解吸液體積（mL）。

1.2.3.2 靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線 稱取10.0g AB-8濕樹脂于500mL三角瓶中，加入黃酮濃度為1mg/mL的樣液200mL，室溫置于搖床上，振蕩12h，每小時定時取樣2.5mL，測定吸附余液黃酮的濃度，計算吸附率。

1.2.4 大孔樹脂對柿葉黃酮的動態(tài)吸附和解吸 將預(yù)處理好的AB-8樹脂濕法裝入（1cm×40cm）玻璃層析柱中，將柿葉黃酮提取液上柱，對上樣流速、濃度、洗脫液濃度及流速等進行動態(tài)吸附與解吸實驗。實驗中待樣液全部通過樹脂柱后，用去離子水洗至流出液無色，再用不同濃度的乙醇以一定速度洗脫，收集洗脫液，測定總黃酮含量。

1.2.5 總黃酮的測定方法 以蘆丁為對照品，采用三氯化鋁比色法［9］。

標(biāo)準曲線繪制：精確稱取一定量經(jīng)干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準品，用30%乙醇配制0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準溶液。分別量取蘆丁標(biāo)準液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6個25mL容量瓶中，各加入1%AlCl3溶液10mL，用30%乙醇定容至25mL，靜置15min。在416nm處，以零管作參比，測定各組溶液的吸光度值，并以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，如圖1所示，求得回歸方程為y=27.757x+0.0028，R2=0.9999。在相同條件下測定各樣品的吸光度，并由式（3）計算樣品的黃酮得率。

式中：c為提取液總黃酮的濃度（mg/mL）；v為提取液的總體積（mL）；m為樣品的質(zhì)量（mg）。

圖1 蘆丁對照品標(biāo)準曲線

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 實驗數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計軟件進行分析統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附實驗結(jié)果

2.1.1 不同樹脂對柿葉黃酮的吸附率及解吸率 由圖2可以看出，ADS-17樹脂的吸附率太低，AB-8、D3520樹脂都具有較大的吸附率和解吸率，而且比較接近，從價格上考慮，本實驗確定AB-8樹脂為實驗用樹脂。

圖2 三種樹脂對柿葉黃酮的吸附率及解吸率

2.1.2 AB-8樹脂對柿葉黃酮的靜態(tài)吸附動力學(xué)特性實驗結(jié)果 合適的吸附樹脂除了具有較大的吸附容量、吸附率和解吸率外，同時還要有較快的吸附速率。實驗對AB-8樹脂進行吸附動力學(xué)實驗，結(jié)果如圖3所示。

圖3 AB-8樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

從圖3可以看出，AB-8樹脂對柿葉黃酮的吸附為快速平衡型，在5h后基本達到平衡，起始階段的吸附量都較大，但總體上來看，AB-8型樹脂對柿葉黃酮具有良好的吸附動力學(xué)特性。綜上分析可知，AB-8樹脂對柿葉黃酮具有良好的吸附解吸特性，適合柿葉黃酮的分離純化。

2.1.3 AB-8樹脂對柿葉黃酮的靜態(tài)吸附結(jié)果

2.1.3.1 吸附溫度的影響 不同的溫度下樹脂對柿葉黃酮吸附率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 吸附溫度對柿葉黃酮吸附率的影響

從圖4中可以看出，隨著吸附溫度的升高，吸附率逐漸提高，20℃的吸附率為68.3%，30℃的吸附率為74.7%，40℃的吸附率為76.3%，可見30℃之后，吸附率隨溫度升高就不再明顯，且溫度越高對實際生產(chǎn)而言成本也就越大。綜合考慮選擇30℃作為吸附溫度。

2.1.3.2 吸附pH的影響 不同pH條件對樹脂吸附柿葉黃酮的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 吸附pH對柿葉黃酮吸附率的影響

從圖5可以看出，pH對吸附率的影響不明顯，柿葉黃酮提取液自身的pH為6，在此條件下的吸附率也較高，考慮到實際操作難易，實驗選擇提取液自身的pH條件。

2.2 AB-8樹脂對柿葉黃酮的動態(tài)吸附結(jié)果

2.2.1 上樣流速的影響 通過調(diào)節(jié)流速對上柱樣液進行吸附流速的選擇，上樣濃度均為3mg/mL，制流速分別為1、2、3、4、5BV/h，進行動態(tài)吸附，五種流速下的吸附率如圖6所示。

圖6 上樣速度對柿葉黃酮吸附率的影響

由圖6可知，流速為1BV/h時吸附率最大，但是1BV/h的流速因為過慢，上樣時間長，導(dǎo)致循環(huán)周期延長，并且由計算得出流速為1BV/h與流速為2BV/h時的漏點分別出現(xiàn)在26mL和22mL，兩者相差不大，所以選擇2BV/h的流速比較合適。

2.2.2 上樣濃度的影響 通過調(diào)節(jié)上柱樣液濃度分別為1、2、3、4、5mg/mL，進行吸附濃度的選擇，控制流速為2BV/h進行動態(tài)吸附，五種吸附濃度下的吸附率如圖7所示。

由圖7可知，隨著上樣濃度的增加，吸附率也不斷增大，當(dāng)上樣濃度達到3mg/mL時變化很小，且濃度越大越容易出現(xiàn)沉淀，所以選擇上樣濃度為3mg/ mL比較合適。

2.2.3 洗脫液濃度的影響 分別用 40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶劑進行洗脫，解吸流速控制為2BV/h，分別將各次洗脫的組分合并，然后測定它們的吸光度，計算解吸率，結(jié)果見圖8所示。

圖7 上樣濃度對柿葉黃酮吸附率的影響

圖8 乙醇濃度對柿葉黃酮吸附率的影響

由圖8可以得出，以80%乙醇和70%乙醇洗脫效果最好，且比較接近，其次為60%的乙醇。綜合考慮解吸率和原料節(jié)省，選擇70%的乙醇作為洗脫劑較好。

2.2.4 洗脫流速的影響 在確定洗脫劑的最佳濃度后，還需要對洗脫流速進行確定，用70%的乙醇洗脫，控制流速分別為1、2、3、4、5BV/h，進行動態(tài)解吸，五種洗脫流速下的解吸率如圖9所示。

圖9 洗脫流速對柿葉黃酮吸附率的影響

由圖9可以看出，以1BV/h和2BV/h的流速進行洗脫得到的解吸率均較高，為了縮短循環(huán)周期，選擇流速較大的2BV/h為宜。

2.3 AB-8樹脂對柿葉黃酮的動態(tài)解吸曲線

將3mg/mL的上樣液加入到預(yù)處理好的AB-8樹脂柱中，按上述確定的吸附洗脫條件進行動態(tài)吸附和洗脫。分段收集洗脫液，測定吸光度，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖10。

由圖10可知，在此條件下洗脫曲線峰窄，且沒出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。當(dāng)洗脫劑體積為40mL時，乙醇洗脫液中總黃酮含量最高，故確定洗脫液體積為80mL（約3BV）。

圖10 流出液體積與吸光度的關(guān)系圖

3 結(jié)論

通過對所選三種樹脂對柿葉黃酮的吸附與解吸性能的研究，篩選出AB-8樹脂為理想的柿葉黃酮分離純化的樹脂，其吸附率為70.9%，解吸率為93.3%，吸附5h達到平衡。AB-8樹脂在30℃下對柿葉黃酮吸附分離的最佳工藝參數(shù)為：上柱液pH為6，上柱速度2BV/h，上樣濃度為3mg/mL，以70%乙醇為洗脫液控制洗脫液流速2BV/h，洗脫劑用量3BV。在此條件下，柿葉黃酮的含量由9%提高到34%，說明AB-8樹脂可有效地分離純化柿葉黃酮。

［1］譚仁祥.植物成分分析［M］.北京：科學(xué)出版社，2002：486-502.

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（下冊）［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986：1526-1527.

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Separation and purification process of total flavonoids from persimmon leaf with AB-8 resin

MA Yan-yan，LU Xiao-xiang*
（Biotechnology and Food Science College，Tianjin University of Commerce，Tianjin Key Laboratory Food of Biotechnology，Tianjin 300134，China）

Objective：To choose the optimum resin for separation and purification of persimmon leaf flavonoids and analyze influenceable factors of separation and purification process.Methods：Three macroporous resins including AB-8，ADS-17and D3520 were used for separation of total flavonoids from persimmon leaf.During the adsorption and desorption process，with UV to assay total flavonoids，the different macroporous resins and their capacities were studied.Results：AB-8 resin possesses had much higher adsorption and desorption capacity.The optimum conditions were：the pH value of sample 6，current velocity 2BV/h，concentration of sample 3mg/mL，70%alcohol as eluant for desorption，current velocity 2BV/h and eluant volume 3BV.An enriched total flavonoids extract with 34%purity can be separated from crude persimmon leaf extrac（tabout 9%purity）in this way.Conclusion：lt is feasible to separate and purify persimmon leaf flavonoids with AB-8 resin.

persimmon leaf；flavomoids；macroporous resin；separation and purification

TS201.1

B

1002-0306（2011）01-0243-04

2010-01-14 *通訊聯(lián)系人

馬燕燕（1985-），女，在讀碩士，研究方向：食物資源研究與開發(fā)。