崔韶暉，馬 堃，趙軼男，張樹彪

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/國家民委-教育部重點實驗室遼寧省高校重點實驗室，遼寧大連116605）

小麥粉中神經(jīng)酰胺類物質(zhì)的提取及結(jié)構(gòu)分析

崔韶暉，馬 堃，趙軼男，張樹彪

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/國家民委-教育部重點實驗室遼寧省高校重點實驗室，遼寧大連116605）

從小麥粉中提取純化了一種神經(jīng)酰胺類物質(zhì)，并對其結(jié)構(gòu)進行了分析。實驗以小麥粉為材料，首先用索氏提取法以95%乙醇為溶劑進行粗提，粗提物經(jīng)石油醚萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，過三次硅膠柱層析提取，再經(jīng)二次重結(jié)晶純化，得到白色無定型粉末狀神經(jīng)酰胺類物質(zhì)。使用高效液相色譜/蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC/ELSD）對其進行純度檢測，用紅外光譜（IR）和質(zhì)譜（MS）對其結(jié)構(gòu)進行鑒定。實驗結(jié)果分析表明該物質(zhì)為分子量397.3，分子式C24H47NO3的神經(jīng)酰胺類化合物。

小麥粉，神經(jīng)酰胺，HPLC/ELSD，IR，MS

神經(jīng)酰胺（Ceramide，Cer）類物質(zhì)是皮膚角質(zhì)層的重要組成成分，同時作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，通過活化多種蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，從而調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡及損傷等多種生理、病理過程［1］。近年來，隨著對神經(jīng)酰胺類物質(zhì)生物活性的研究與應(yīng)用開發(fā)，這類物質(zhì)已經(jīng)成為功能性保健品、食品和化妝品等的重要有效活性成分，具有非常重要的應(yīng)用價值。但是，由于神經(jīng)酰胺在生物試樣中的含量極低，而且分子結(jié)構(gòu)存在多樣性，導(dǎo)致天然神經(jīng)酰胺的提取和分析比較困難［2］。天然植物中含有的神經(jīng)酰胺具有良好的生物活性和安全性，因此，從各種植物中分離提取此類化合物的研究受到廣泛關(guān)注［3-4］。本研究首次從來源廣泛、成本較低的小麥粉中提取到一種神經(jīng)酰胺類物質(zhì)，并對其結(jié)構(gòu)進行了分析，為今后開發(fā)利用植物中的神經(jīng)酰胺提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥粉；C2-Cer 購于 Sigma公司，純度為98%；乙腈、四氫呋喃、異丙醇、甲醇、正丙醇 色譜純試劑，購于天津科密歐公司；層析硅膠 100～200目，購于上海五四化學(xué)試劑公司；95%乙醇、石油醚、丙酮、三乙胺、甲酸、甲醇等 均為國產(chǎn)分析純試劑。

索氏提取器，Z型層析柱，BüCHI R-220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，LC-10AD高效液相色譜儀/蒸發(fā)光散射檢測器，HP 1100MSD型質(zhì)譜儀，F(xiàn)REEZONE4.5型真空冷凍干燥機，F(xiàn)TIR-8101紅外光譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 神經(jīng)酰胺的粗提 稱取20g小麥粉裝入索氏提取器中，在250mL圓底燒瓶中加入95%乙醇150mL，水浴恒溫 80～90℃，用索氏提取法提取8～10h。同法提取20次，合并提取液后過濾，用去離子水將濾液中乙醇濃度調(diào)至70%后，用石油醚萃取，萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后用于柱層析。

1.2.2 柱層析分離 濃縮液經(jīng)硅膠柱層析三次分離純化，洗脫液為（石油醚∶丙酮=7∶3）200mL，洗脫流速為1d/s，收集后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。

1.2.3 真空冷凍干燥 將上步得到的濃縮液進行真空冷凍干燥，析出白色的粉末狀固體。

1.2.4 重結(jié)晶純化 將得到的粉末狀固體溶于丙酮中，加熱溶解后用真空泵進行快速抽濾，將濾液濃縮后，低溫4℃放置，待有固體物析出，進行抽真空干燥，重復(fù)多次重結(jié)晶純化。

1.2.5 高效液相色譜/蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC/ ELSD）分析［5］HPLC分析所用色譜柱為 Kromasil C18柱，流動相A為乙腈∶四氫呋喃=95∶5（10mmol/L三乙胺+10mmol/L甲酸）；B為乙腈∶四氫呋喃∶異丙醇=40∶5∶55（10mmol/L三乙胺+10mmol/L甲酸），流速為0.6mL/min，進行梯度洗脫，洗脫時間設(shè)定為15min：T=0min（A=100%）；T=15min（B=100%），蒸發(fā)光散射檢測器溫度設(shè)為30℃。

1.2.6 紅外光譜（IR）分析 采用FTIR-8101紅外光譜儀，KBr壓片法。

1.2.7 質(zhì)譜（MS）分析［6］采用HP 1100MSD型質(zhì)譜儀，質(zhì)譜條件為正離子模式，霧化氣流為3L/min，氣簾氣壓為11PSI，離子源電壓為5000V。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜（HPLC/ELSD）檢測神經(jīng)酰胺提取物的純度

將從小麥粉中提取純化的白色無定型粉末溶于色譜純的正丙醇中用于HPLC/ELSD分析測定，使用梯度洗脫法，經(jīng)過多次測定只得到一個主峰，樣品峰保留時間為3.233min，雜質(zhì)含量很少，表明提取的化合物純度較高，結(jié)果如圖1所示。

圖1 小麥粉中神經(jīng)酰胺類提取物的高效液相色譜（HPLC/ELSD）圖

2.2 提取物的紅外光譜（IR）分析

將純化的提取物進行紅外光譜（IR）分析，譜圖如圖 2所示，IR譜顯示有酰胺的特征吸收峰（3449.1、1740.0、1454.5、1275.1cm-1）和 羥 基（2926.4cm-1）、長鏈脂肪烷基（723.4cm-1）的特征吸收峰，分析表明在3449.1cm-1處產(chǎn)生一弱峰，即存在仲酰胺的 VN-H伸縮振動，說明含有-NH-基團；1740.0cm-1產(chǎn)生一強峰，即存在酰胺基團中的C=O伸縮振動，說明含有酰胺基團；1275.1cm-1處峰是仲酰胺VC-H基團的特征峰；1454.5cm-1處峰是仲酰胺δN-H基團的特征峰。同法分析了購于Sigma公司的C2-Cer（98%），對照比較了官能團的特征吸收峰見圖3所示，結(jié)果表明，該提取物為含有羥基的仲酰胺化合物，區(qū)別是含有的碳鏈長度不同。

圖2 小麥粉中神經(jīng)酰胺類提取物的紅外光譜（IR）譜圖

圖3 C2-Cer的紅外（IR）光譜圖

2.3 質(zhì)譜（MS）分析提取物的分子結(jié)構(gòu)和分子量

將純化的提取物進行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜圖如圖4所示，在m/z=398.3處得到一個較強的響應(yīng)峰，因為分析模式為［M+1］+模式，表明該化合物分子量為397.3，結(jié)合紅外光譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析并計算得出該神經(jīng)酰胺類化合物的分子式為：C24H47NO3。

圖4 小麥粉中神經(jīng)酰胺類提取物的質(zhì)譜譜圖

3 討論

神經(jīng)酰胺類物質(zhì)雖然廣泛存在于動、植物中，但由于天然神經(jīng)酰胺分子結(jié)構(gòu)具有多樣性，以及它在生物試樣中的含量極低，沒有紫外和熒光發(fā)色團，也很難被衍生化，導(dǎo)致神經(jīng)酰胺的分離和分析比較困難［7］。本研究從小麥粉中提取的一種神經(jīng)酰胺類化合物，采用HPLC/ELSD系統(tǒng)直接對其進行了分析，不需要任何的衍生化過程，方便可靠。作為對照使用紫外檢測器的HPLC沒有吸收。進一步使用紅外光譜和質(zhì)譜對提取物進行了結(jié)構(gòu)上的分析，紅外光譜數(shù)據(jù)分析表明含有仲酰胺基團、-OH基團、C骨架等，該分析結(jié)果與從Sigma公司購買的C2-神經(jīng)酰胺進行了對照分析，可確定為神經(jīng)酰胺類化合物，其分子量為397.3，分子式為：C24H47NO3。今后將在此基礎(chǔ)上對其分子結(jié)構(gòu)進行進一步明確分析。本實驗室先前研究了魔芋粉中神經(jīng)酰胺類物質(zhì)的分離提取和分析［8］。盡管對天然植物中神經(jīng)酰胺的分析研究已經(jīng)持續(xù)了幾十年，然而目前仍沒有一種令人滿意的高效提取分析方法，根據(jù)神經(jīng)酰胺樣品的來源、含量、種類和不同的使用目的，發(fā)展高效分離和分析技術(shù)將是推動神經(jīng)酰胺應(yīng)用及其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要基礎(chǔ)和技術(shù)關(guān)鍵。

［1］Hannun Y A.Functions of ceramide in coordinating cellular responses to stress［J］.Science，1996，274：1885-1859.

［2］孫慶杰.天然神經(jīng)酰胺的研究與開發(fā)［J］.中國油脂，2003，28（2）：11-15.

［3］陳玉，楊光忠，李援朝.雷公藤中神經(jīng)酰胺類化合物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定［J］.華中師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，39（2）：225-227.

［4］徐石海，曾隴梅，蘇鏡娛.兩種神經(jīng)酰胺分離與結(jié)構(gòu)鑒定［J］.中山大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1997，36（2）：84-87.

［5］CremestiA E，F(xiàn)ischlA S.Currentmethodsforthe identification and quantitation of ceramides［J］.Lipids，2000，35（9）：937-945.

［6］Raith K，Neubert R.Liquid chromatography elect rospray mass spectrometry and tandem mass spectrometry of ceramides［J］.Analytica Chimica Acta，2000，403：295-303.

［7］謝建平，張敏蓮，劉錚.神經(jīng)酰胺及其分析與分離技術(shù)研究進展［J］.精細(xì)化工，2002，9（7）：31-35.

［8］崔韶暉，姜波，關(guān)翔宇，等.魔芋中神經(jīng)酰胺類物質(zhì)的分離提取和分析［J］.生物技術(shù)，2007（5）：45-47.

Extraction and structure analysis of a species of ceramide from wheat powder

CUI Shao-hui，MA Kun，ZHAO Yi-nan，ZHANG Shu-biao
（Key Laboratory of Ministry of Education-The State Ethnic Affairs Commission，Key Laboratory of University of Liaoning Province/Life Science College，Dalian Nationalities University，Dalian 116605，China）

A species of ceramide homolog from wheat powder was extracted and purified and its structure analysis was carried out.Wheat powder was treated with 95%of ethanol by means of sorbitic extraction at first.Then the crude product was extracted from petroleum ether，concentrated by rotatory evaporator，extracted three times by silica gel column chromatography，recrystallized twice，respectively，and white undefined ceramide powder was obtained.By means of HPLC/ELSD，the purity of the product was detected.lts structure was characterized via lR and MS spectroscopy.Experimental results showed that the molecular weight of the ceramide was 397.3，molecular formula was C24H47NO3.

wheat powder；ceramide；HPLC/ELSD；lR；MS

TS210.1

A

1002-0306（2011）02-0079-03

2009-07-08

崔韶暉（1966-），女，博士，副教授，主要從事化學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域的研究。

遼寧省博士啟動基金項目（20031082）；大連民族學(xué)院人才引進基金（20036209）。