項(xiàng)麗麗，季妮娜，粘靖祺，霍貴成

（乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

響應(yīng)面法對(duì)乳清中乳糖酶解工藝條件的研究

項(xiàng)麗麗，季妮娜，粘靖祺，霍貴成*

（乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

對(duì)乳清中的乳糖在β-半乳糖苷酶催化下的水解作用進(jìn)行了研究，利用響應(yīng)面方法系統(tǒng)地考察了不同的工藝參數(shù)（酶添加量、pH和溫度）對(duì)乳糖水解度的影響。通過響應(yīng)面模型確定了酶水解乳清中乳糖的最優(yōu)條件，即乳糖酶添加量1.03g/kg乳清、pH6.73、水解溫度為37.26℃，在此條件下水解3h，乳糖水解度為66.02%。

乳清，乳糖水解，β-半乳糖苷酶，響應(yīng)面法

乳清是干酪制作時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物，過去通常被當(dāng)作廢物處理掉，但由于其乳糖含量較高，極易腐敗，大量消耗水中的溶解氧，從而造成了很嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。另外，乳清還是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和多種維生素及礦物質(zhì)的良好來源。近年來，世界各國(guó)的學(xué)者們都在努力尋找恰當(dāng)?shù)耐緩絹韺⑷榍甯玫亻_發(fā)利用到食品中［1］。β-半乳糖苷酶是嗜熱乳酸菌產(chǎn)生的一種胞內(nèi)酶，它可以將牛乳或乳清中的乳糖水解成兩部分：半乳糖和葡萄糖，由于水解后的混合糖漿要比乳糖本身甜［2］，而且更容易被人消化吸收［3］，解除乳糖不耐癥人群的困擾。因此，用β-半乳糖苷酶水解乳糖后的乳清可以直接發(fā)酵成乳清飲料或應(yīng)用在糖果、糕點(diǎn)等食品加工中。本實(shí)驗(yàn)旨在采用響應(yīng)面方法，通過Design-Expert 6.0軟件分析數(shù)據(jù)，得到回歸方程，最終確定β-半乳糖苷酶水解乳清中乳糖的最佳工藝參數(shù)，為今后生產(chǎn)和研究低乳糖乳清飲料和其他產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

脫鹽乳清粉D90 法國(guó)愛慕公司，乳糖84%、水分2%、蛋白質(zhì)12.2%、脂肪1%、灰分0.7%；β-半乳糖苷酶 哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司；鹽酸、氫氧化鈉 均為分析純。

葡萄糖測(cè)定試劑盒 上海榮盛生物技術(shù)有限公司；DELTA320精密pH計(jì)、PL2002分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；搖床振蕩培養(yǎng)箱 上海智成分析儀器有限公司；UV2401PC紫外可見光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳糖酶水解工藝流程 乳清粉→復(fù)原（10%）→用2mol/L NaOH或1mol/L HCl調(diào)整pH→殺菌→冷卻降溫→加入乳糖酶→放入搖床中保溫水解3h→加熱滅酶→冷卻降溫→測(cè)水解率

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 殺菌條件 復(fù)原后的乳清采用巴氏殺菌，水浴65℃，30min后冷水冷卻至40℃左右。

1.2.2.2 添加乳糖酶 在無菌條件下將稱量好的乳糖酶添加到乳清中，然后立即放入搖床中振蕩水解。

1.2.2.3 搖床振蕩條件 使用前先升溫至所需溫度，調(diào)整搖床轉(zhuǎn)速200r/min。

1.2.2.4 滅酶 水解完畢后，將水解液立即放入水浴鍋中95℃，5min使酶失活。

表1 中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表

1.2.3 響應(yīng)面方法分析 采用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析并作圖，選擇pH（x1），酶添加量（x2）和水解溫度（x3）三個(gè)因素，軟件根據(jù)中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)（CCRD）［4］對(duì)各因素進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)因素包含五個(gè)水平，編碼為-α、-1、0、+1、+α，α=2因素個(gè)數(shù)/4=23/4= 1.682，0水平表示實(shí)驗(yàn)所選擇的中心點(diǎn)，-1和+1表示上水平和下水平，中心點(diǎn)選擇依據(jù)為乳糖酶使用說明書及前期所做的摸索性實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)組合均做3次重復(fù)，并以乳糖水解度（DH，%）的平均值作為響應(yīng)值。響應(yīng)面方法分析數(shù)據(jù)的方式可以通過下面的二次方程來解釋：

其中，y是響應(yīng)變量（乳糖水解率DH%），β0是設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值，βi、βii和βij分別是線性、二次項(xiàng)和交叉相乘或交互回歸項(xiàng)的系數(shù)，xi、xj是獨(dú)立變量的編碼（x1：pH，x2：酶添加量，x3：水解溫度）［5］。利用F-檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)得到的回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。具體的實(shí)驗(yàn)編碼表見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

1.2.4 乳糖含量的測(cè)定 采用直接滴定法（GBT5009.7-2003）測(cè)定乳清粉中的乳糖含量。

1.2.5 乳糖水解率的測(cè)定 采用酶催化法［6］。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面模型的建立與檢驗(yàn)

采用Design-Expert軟件，以表1的因素水平制備23組乳糖水解液，其中，中心點(diǎn)處重復(fù)9次，分別測(cè)定其水解度，實(shí)施方案及結(jié)果見表2。對(duì)所得到的響應(yīng)面模型進(jìn)行方差分析（ANOVA），結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析

可知，在5%顯著水平上，除交互項(xiàng)pH與酶添加量外，所有因素及其交互項(xiàng)對(duì)乳清中乳糖水解度均有顯著作用（P＜0.05），而模型失擬項(xiàng)為不顯著（P＞0.05），這更說明此模型適合乳糖水解度的分析。模型的擬合度R2為0.9793（R2＞0.75表明模型具有實(shí)用性），說明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性；校正決定系數(shù)為0.9650，說明該模型能解釋96.50%的響應(yīng)值的變化，僅有3.5%不能用此模型來解釋。通過比較F值大小，我們可以分析各個(gè)因素對(duì)水解度影響的重要程度。從表3可知，3個(gè)一次項(xiàng)的F值大小依次為x3＞x2＞x1，且各項(xiàng)的F值檢驗(yàn)均達(dá)到了極顯著的水平（P＜0.01），說明3個(gè)因子對(duì)乳糖水解度均存在極顯著的影響。從交互項(xiàng)的回歸系數(shù)可知，只有x1和x2之間的交互作用不顯著，而其他因子之間的交互作用均顯著。

根據(jù)各項(xiàng)的回歸系數(shù)，得到三因素對(duì)乳清中乳糖水解度影響的回歸方程：

將實(shí)際值替換編碼值，并去掉作用不顯著項(xiàng)，可得到實(shí)際回歸方程：

其中，y為乳糖水解度（%）。

2.2 pH、酶添加量及水解溫度對(duì)響應(yīng)值的影響

為得到乳糖水解度最大值時(shí)各因素的最佳條件，分別將各因素固定在中心點(diǎn)，利用Design-Expert軟件作出其他兩個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值作用的響應(yīng)面圖，如圖1～圖3所示。

圖1 pH和水解溫度對(duì)水解度的影響

圖2 水解溫度和酶添加量對(duì)水解度的影響

圖3 酶添加量和pH對(duì)水解度的影響

由圖1可以看出，將乳糖酶添加量固定在0水平時(shí)，乳糖水解度先是隨著pH和水解溫度的升高而增加，到達(dá)最優(yōu)點(diǎn)后則開始降低，在二者的交互作用中，溫度和pH對(duì)響應(yīng)值的影響作用都很明顯。當(dāng)溫度高于45℃和pH低于6.2時(shí)，酶基本失活，水解度迅速降低，同理，在低溫和高pH條件下，酶活性也不很穩(wěn)定。

當(dāng)把pH固定在0水平時(shí)，響應(yīng)值可以達(dá)到的最大值為69.25%，如圖2所示，在水解溫度和酶添加量的交互作用中，水解溫度是影響水解度的主要因素，在適當(dāng)?shù)乃鉁囟葪l件下，增加酶添加量，可獲得較高的水解度。

同樣，圖3顯示的是當(dāng)水解溫度固定在0水平時(shí)，pH和酶添加量對(duì)乳糖水解度的影響，可見pH對(duì)響應(yīng)值的影響較大，在適當(dāng)?shù)膒H條件下，隨著酶添加量的增加，水解度呈增大趨勢(shì)。

2.3 最優(yōu)水解條件的確定

綜合2.2中的分析，兼顧考慮乳糖酶的使用量和節(jié)約能源，將酶添加量控制在0.8～1.2g/kg，水解溫度定為30～40℃，再利用Design-Expert軟件分析，得到最佳點(diǎn)處 pH6.73，酶添加量 1.03g/kg，水解溫度37.26℃，此條件下水解3h，乳糖的水解度可達(dá)到66.02%，但比徐寧等人得到的結(jié)論［7］偏低，可能是由于乳糖酶存放時(shí)間過長(zhǎng)，酶活力降低所致。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面方法確定了β-半乳糖苷酶水解乳清中乳糖的最佳水解條件，當(dāng)乳清pH為6.73，酶添加量1.03g/kg，水解溫度37.26℃時(shí)，水解3h后可獲得乳糖最大水解度為66.02%，而且此時(shí)得到的水解液略帶奶香，口感香甜，可以作為進(jìn)一步發(fā)酵生產(chǎn)低乳糖乳清飲料的基液。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅為乳糖酶在乳清中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，而且為國(guó)內(nèi)低乳糖乳清飲品的開發(fā)開辟了新的途徑。

［1］Djuric M，Caric M，Spasenija M，et al.Development of wheybased beverages［J］.Eur Food Res Technol，2004，219（4）：321-328.

［2］趙少華.Maxilact乳品酵母乳糖酶在牛奶和乳清中的應(yīng)用［J］.食品工業(yè)科技，2007，9（5）：44-46.

［3］Vasiljevic T，Jelen P.Production of β-galactosidase for lactose hydrolysis in milk and dairy products［J］.Innovative Food Scienceamp;Emerging Technologies，2001，2（2）：75-85.

［4］Panesar P S.Application of response surface methodology in the permeabilization of yeast cells for lactose hydrolysis［J］. Biochemical Engineering Journal，2008，39：91-96.

［5］Guo Y X，Pan D D.Optimization of hydrolysis conditions for the production of the angiotensin-I converting enzyme（ACE）inhibitory peptides from whey protein using response surface methodology［J］.Food Chemistry，2009，114：328-333.

［6］王輝.低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝及乳糖水解率測(cè)定方法的研究［D］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

［7］徐寧，孫波，遲玉杰.以乳清為原料酶法水解乳糖條件的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（12）：286-290.

Study on the technology condition of enzymatic hydrolyzing lactose in whey using response surface methodology

XIANG Li-li，JI Ni-na，NIAN Jing-qi，HUO Gui-cheng*
（Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Using response surface methodology for enzymatic hydrolysis of lactose in whey，the effects of different parameters（β-galactosidase dosage，pH and temperature）on the hydrolysis degree（DH）of lactose were investigated.The optimum technology conditions for enzymatic hydrolysis of lactose in whey were 1.03g/kg β-galactosidase dosage，pH6.73 and 37.26℃.Under these conditions of process variables，DH of the lactose in whey was 66.02%after 3h of treatment.

whey；lactose hydrolysis；β-galactosidase；response surface methodology

TS201.2+3

B

1002-0306（2011）02-0233-03

2010-03-09 *通訊聯(lián)系人

項(xiàng)麗麗（1984-），女，在讀碩士，研究方向：乳品科學(xué)。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物乳業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（CXT007-2）。