聶重重 吳海龍 卿湘東 李元娜 李 勇 許 慧 朱紹華 俞汝勤

(湖南大學化學化工學院，化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，長沙 410082)

三維熒光二階校正法快速測定環(huán)境水體和淤泥樣中麥穗寧殘留量*

聶重重 吳海龍＊＊卿湘東 李元娜 李 勇 許 慧 朱紹華 俞汝勤

(湖南大學化學化工學院，化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，長沙 410082)

將激發(fā)發(fā)射熒光光譜與化學計量學基于交替三線性分解(ATLD)算法的二階校正方法相結合，實現了自來水、湘江水、池塘水、雨水和淤泥5種實際復雜體系中麥穗寧含量的直接快速定量測定.當選取組分數為2時，用ATLD算法分辨獲得的平均回收率分別為(100.5±1.3)%、(93.8±1.1)%、(95.0±2.1)%、(98.2 ±2.3)% 和(91.3 ±1.6)%，檢測下限(LOD)分別為 0.58、1.38、4.47、5.60、0.43 pg·mL－1.另外，還用橢圓置信區(qū)間(EJCR)測試，品質因子如靈敏度(SEN)、選擇性(SEL)和定量檢測限(LOQ)評估了方法的準確性.實驗結果表明，該方法能夠實現未知熒光背景干擾共存下麥穗寧含量的直接快速定量測定.

麥穗寧，三維熒光，二階校正，交替三線性分解，化學計量學.

長期以來，由于人們在防治農作物病蟲害過程中不合理和超劑量使用化學農藥，導致農藥殘留量越來越高，影響了人類身體健康，也破壞了農業(yè)生態(tài)環(huán)境［1］.苯并咪唑類殺菌劑是20世紀60年代末、70年代初開發(fā)的一類含有苯并咪唑分子結構的高效、廣譜內吸性殺菌劑，主要有多菌靈、苯菌靈、噻菌靈、麥穗寧、甲基托布津等.麥穗寧(Fuberidazole，簡稱FBZ)，是農業(yè)生產中最重要的苯并咪唑類殺菌劑［1］，廣泛用于收獲前或收獲后防治水果、蔬菜和觀賞植物上的各種病蟲害，也可以直接用于土壤或撒向農田，其殘效期較長，因而麥穗寧殘留在農產品和環(huán)境中比較普遍，對人類身體健康和生態(tài)環(huán)境都有影響，因此對環(huán)境中麥穗寧進行監(jiān)測非常必要.

目前用于測定麥穗寧的方法有液相色譜－熒光檢測法(LC－Fluorescence)［2－5］、流動注射分析熒光檢測法(FIA－Fluorescence)［6］、連續(xù)注射分析可變角掃描熒光法(SIA－VASF)［7］、基于光電傳感器的熒光光譜法［8］等.其中液相色譜法預處理復雜，儀器昂貴且使用大量的有毒溶劑;流動注射分析熒光檢測法在處理實際背景時需要復雜的預富集過程;熒光光譜法儀器費用低，靈敏度高，但選擇性差.由于麥穗寧的熒光光譜與復雜樣品背景的光譜嚴重重疊，因而未經分離直接用光譜的方法檢測環(huán)境水體和淤泥中的麥穗寧幾乎是不可能的.若引入化學計量學方法，以“數學分離”代替化學及物理分離，提高熒光光譜法的選擇性從而實現較低檢測下限，則能實現復雜體系目標成分的直接快速測定.

本文提出了一種激發(fā)發(fā)射熒光與二階校正方法相結合檢測實際環(huán)境體系中麥穗寧的方法.采用基于交替三線性分解(ATLD)［9］算法的二階校正方法與三維熒光光譜相結合，對環(huán)境水體和淤泥樣中的麥穗寧含量進行了直接定量測定，方法簡單快速、綠色，且具有即使有未知干擾共存也不影響其感興趣成分定量分析結果的優(yōu)點.

1 方法原理與實驗部分

1.1 三線性成分模型

將K個樣本在選取激發(fā)波長數為I、發(fā)射波長數為J條件下進行測定，得到的激發(fā)發(fā)射熒光光譜矩陣可構成三維響應數陣X(I×J×K)，它滿足下面這個三線性成分模型:其中N表示對體系有實際貢獻的熒光成分數;xijk是三維響應數陣中的元素，它表示第k個樣本在激發(fā)波長為i、發(fā)射波長為j時的熒光強度;ckn是相對濃度陣C(K×N)中的元素;ain是相對激發(fā)光譜陣A(I×N)中的元素;bjn是相對發(fā)射光譜陣 B(J×N)中的元素;eijk是三維殘差數陣(I×J×K)中的元素.

1.2 交替三線性分解算法［9］(ATLD)

通過利用交替最小二乘原理，借助基于切尾奇異值分解(TSVD)的Moore－Penrose廣義逆計算和交替迭代步驟來改進三線性分解的性能，使損失函數即殘差陣元素的平方總和達到極小化.該算法可同時獲得關于三維數陣的相對激發(fā)光譜陣A，相對發(fā)射光譜陣B以及相對濃度陣C.對A、B、C作適當處理后，再根據文獻［9］的二階校正步驟作未知樣中目標組分的直接定量分析.

1.3 品質因子

分析品質因子，例如靈敏度(SEN)、選擇性(SEL)和檢測下限(LOD)，通常用來驗證預測結果的準確性.在二階校正中，分析品質因子的估計跟純分析信號的計算密切相關，SEN是指單位濃度的純分析信號，而SEL是指靈敏度和總信號的比值.本文根據文獻［10］所報道的公式來計算SEN和SEL:

其中，下標nn代表矩陣的第(n，n)個元素;k為組分n在單位濃度時的總信號，它也是濃度得分參數.根據下式［11－12］估計檢測下限(LOD):

其中，s(0)為3個背景空白樣本的預測濃度偏差.定量檢測限(LOQ)由下式來計算:

1.4 主要儀器與試劑

日立F－4500型熒光分光光度計(日本日立公司)，用1 cm石英比色皿進行激發(fā)－發(fā)射三維熒光掃描;KQ－250TDB型高頻數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，TGL－16A型高速冷凍離心機(德國Sigma公司);手提式壓力蒸汽滅菌器;得到的所有光譜數據使用Matlab軟件處理，ATLD程序和校正過程用到的線性回歸程序均為實驗室自編.

麥穗寧(FBZ)標準品(湖南出入境檢驗檢疫局提供，500.94 μg·mL－1)，無水乙醇、磷酸、磷酸二氫鈉(均為分析純)購自裕豐(中國長沙).自來水(湖南大學化學化工學院)，湘江水(湖南長沙湘江)，池塘水(取自湖南大學逸夫樓旁一池塘)，雨水(湖南長沙岳麓區(qū))，淤泥樣品(采于湖南長沙湘江邊).實驗所有用水均為二次水.

1.5 實驗方法

用乙醇配制 5.0 μg·mL－1的儲備液.實驗時，取適量儲備液用二次水定容，配制5.0 ng·mL－1的工作液.用磷酸二氫鈉、磷酸配制成pH值為2.0的磷酸鹽緩沖溶液，根據文獻［6］，麥穗寧在pH 2.0時熒光強度最大，所以本實驗選取pH 2.0的磷酸鹽緩沖溶液.所有溶液均存放于4℃冰箱中.

湘江水、池塘水、自來水、雨水通過離心除去其中的顆粒懸浮物，過濾，高溫滅菌備用.取淤泥若干，于錐形瓶中用甲醇超聲萃取30 min，然后再離心15 min(7000 r·min－1)，過濾，濾液用旋轉蒸發(fā)器旋干，收集濃縮液高溫滅菌備用.

校正樣的配制(1—10):在10個10 mL容量瓶中分別加入不同體積的麥穗寧工作液和2 mL磷酸鹽緩沖溶液，用二次水定容，保持麥穗寧的濃度在0—250.5 pg·mL－1范圍內(在此范圍內，麥穗寧的熒光信號強度與其濃度呈正比關系).

驗證樣的配制(11—18):8個驗證樣的配制方法與校正樣類似，麥穗寧的濃度在校正樣的濃度范圍之內.

實際樣的配制:平行配制自來水、湘江水、池塘水、雨水和淤泥5組30個實際樣，在每組6個10 mL容量瓶中分別加入不同體積的麥穗寧工作液(濃度見表1)和2 mL磷酸鹽緩沖溶液，再分別加入自來水、湘江水、池塘水、雨水和淤泥提取液作為基質干擾，用二次水定容.實際樣的濃度在校正樣的濃度范圍內.

為了避免瑞利散射峰的影響，本文選取激發(fā)波長范圍為264—340 nm，間隔2 nm取一個數據;發(fā)射波長范圍為 326—425 nm，間隔 3 nm取一個數據;狹縫寬度為 5.0/5.0 nm;掃描速度為1200 nm·min－1.在對樣本進行三維熒光光譜掃描過程中，分別在掃描前、中、后測定3個緩沖液空白樣本，通過扣除空白樣本的平均值，可以盡可能地減少溶劑引起的拉曼散射、瑞利散射和衍射的影響.另外，5種高溫滅菌液各平行測定3次作為背景空白樣本，用于計算背景預測濃度的標準偏差s(0).

2 結果與討論

2.1 驗證樣分析

采用ATLD算法對校正樣和驗證樣(1—18)進行解析.算法解析得到驗證樣的(11—18)預測濃度與真實的添加濃度非常接近，麥穗寧的平均回收率為(101.3±1.7)%，線性相關系數為0.9994.對于人工合成樣，ATLD給出了滿意的結果，但是本文所用方法具有的“二階優(yōu)勢”沒有充分體現.為充分體現其優(yōu)勢，在下面實驗中嘗試在環(huán)境水體和淤泥中測定麥穗寧的含量.

2.2 環(huán)境水體和淤泥樣中FBZ激發(fā)發(fā)射光譜

在對環(huán)境水體和淤泥樣中麥穗寧進行濃度預測之前，首先利用核一致診斷法(CORCONDIA)［13］對所得到的三維數陣(湘江水樣)進行秩估計，得到結果如圖1所示.前二個因子所對應的核一致值為1.0，當選擇因子數為3時，核一致值小于0.6，因此該三維陣的化學秩為2，即2個因子.在選擇的三維熒光掃描范圍內，待分析物麥穗寧都有很強的熒光，因此可知FBZ為該三維模型貢獻了1個組分;另外1個組分是由背景干擾物質貢獻給模型的.同理，其余背景成分數也均為2.

圖1 利用核一致法預估計三維數據陣的秩(湘江水)Fig.1 Estimating the rank of a three－way data array by using CORCONDIA method(river water)

用ATLD算法分辨得到的自來水、湘江水、池塘水、雨水和淤泥中FBZ的相對激發(fā)光譜和發(fā)射光譜圖見圖2.可以明顯看出實際體系中待分析物FBZ的激發(fā)發(fā)射光譜與內源物質即基體的光譜嚴重重疊，但用ATLD算法分辨得到的激發(fā)發(fā)射光譜與真實光譜非常吻合，且對于不同的實際樣，算法每次分辨出的背景基體的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜完全不一致，但分辨出的FBZ的激發(fā)和發(fā)射熒光光譜卻基本上沒有變化，都與純的FBZ光譜幾乎完全吻合，說明經ATLD算法分辨得到的FBZ激發(fā)和發(fā)射光譜在不同背景中是一致的、可靠的，驗證了三線性分解的唯一性及本方法的可靠性.另外從分辨得到的相對光譜數據可知，FBZ的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為314 nm和353 nm.

2.3 環(huán)境水體和淤泥樣中FBZ的測定及回收率

從分辨得到的光譜圖可知，環(huán)境水體和淤泥樣中的待測組分FBZ的熒光光譜與內源物質背景光譜嚴重重疊，給FBZ的直接定量測定帶來系統(tǒng)誤差.因此，僅用一般熒光分析方法不經過化學分離就直接對樣品進行定量分析幾乎是不可能的，而具有“二階優(yōu)勢”的化學計量學方法與三維熒光分析相結合，用“數學分離”代替繁瑣的化學或物理分離，則可以很好地在未知干擾共存下對目標成分進行定量分析.

圖2 5種實際復雜體系中FBZ的真實光譜和用ATLD算法分辨得到的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(N=2)(－ － － － － －真實的;——分辨得到的;……分辨得到的背景;a1、b1自來水樣;a2、b2湘江水樣;a3、b3池塘水樣;a4、b4雨水樣;a5、b5淤泥樣)Fig.2 Actual and mathematically resolved excitation and emission spectra of FBZ using ATLD in five complicated samples when the component number was chosen as two

按實驗方法測定環(huán)境水體和淤泥樣中的FBZ，用激發(fā)發(fā)射熒光掃描獲得的三維響應數陣采用基于ATLD的二階校正方法進行解析，預測濃度結果和平均回收率見表1.對于自來水、湘江水、池塘水、雨水和淤泥實際樣，用 ATLD 算法分析所得的相關系數分別為 0.9984、0.9987、0.9980、0.9975 和 0.9985，平均回收率分別為(100.5 ±1.3)%、(93.8 ±1.1)%、(95.0 ±2.1)%、(98.2 ±2.3)%和(91.3 ±1.6)%.由數據可以看出，該方法可實現環(huán)境水體和淤泥中FBZ的直接快速定量測定，為環(huán)境質量的管理與改善提供了科學依據.

表1 用ATLD算法分辨得到的環(huán)境水體和淤泥樣中FBZ的濃度(N=2)Table 1 Determination of FBZ in aquatic and river sediment samples using ATLD algorithm(N=2)

預測殘差均方根 (RMSEP)［14］:

其中，I為預測樣本數，Cact和Cpred為待測物的真實濃度和預測濃度.

2.4 品質因子和橢圓置信區(qū)間

本文用幾種品質因子，如靈敏度(SEN)、選擇性(SEL)、檢測限(LOD)和定量檢測限(LOQ)評估了所用方法的準確性，其結果見表2.與常用方法相比［1－7］，可以看出本方法的檢測限較低:0.43—5.60 pg·mL－1.為了進一步調查所用方法的準確性，對實際濃度與預測濃度進行了線性回歸分析［15］，接著基于橢圓置信區(qū)間(EJCR)測試［16］，將計算得到的截距和斜率與理想值0和1進行了比較，圖3繪出了ATLD算法的橢圓置信區(qū)間.從圖3中可以看出，對于5種實際樣，理想點(0，1)都在ATLD算法得到的橢圓內，說明該算法可以用于實際復雜體系中目標組分的直接快速選擇性定量分析，并可獲得滿意的結果.

圖3 用ATLD算法得到的橢圓置信區(qū)間Fig.3 Elliptical joint confidence region of the ATLD algorithm

表2 品質因子Table 2 Figures of merit

3 結論

本文用激發(fā)發(fā)射矩陣熒光光譜與化學計量學二階校正方法，相結合測定了環(huán)境水體和淤泥樣中麥穗寧的殘留量.該方法以水作溶劑，利用化學計量學二階校正方法，在背景干擾共存下對環(huán)境水體和淤泥樣中目標組分進行直接快速定量測定.在環(huán)境水體和淤泥樣中采用ATLD算法分辨獲得的平均回收率在91.3%—100.5%之間，相對標準偏差在1.1%—2.3%之間，且檢測限與其它方法相比較低，為0.43—5.60 pg·mL－1.實驗證明，該方法能夠解決實際體系中待分析物光譜與內源熒光物質光譜嚴重重疊所引起的難分辨問題，可以在未知背景干擾共存下對待測組分進行直接、快速、定量分析，并獲得了滿意的結果，且方法簡單、快速、綠色環(huán)保，在環(huán)境檢測、食品安全等領域將是一種很有潛力的分析方法.

［1］Ortelli D，Edder P，Nan?oz J，et al.用LC－MS/MS方法篩查飲用水、礦泉水和環(huán)境水中PPT級的165種農藥［J］.環(huán)境化學，2007，26(3):413－414

［2］López Monzón A，Vega Moreno D，Torres Padrón M E，et al.Solid－phase microextraction of benzimidazole fungicides in environmental liquid samples and HPLC－fluorescence determination［J］.Anal Bioanalytical Chem，2007，387(6):1957－1963

［3］Halko R，Padron Sanz C，Sosa Ferrera Z，et al.Determination of benzimidazole fungicides by HPLC with fluorescence detection after micellar extraction［J］.Chromatographia，2004，60(3/4):151－156

［4］Moral A，Sicilia M D，Rubuo S.Supramolecular solvent－based extraction of benzimidazolic fungicides from natural waters prior to their liquid chromatographic fluorimetric determination［J］.J Chromatogr A，2009，1216(18):3740－3745

［5］Moral A，Sicilia M D，Rubuo S.Determination of benzimidazolic fungicides in fruits and vegetables by supramolecular solvent－based microextraction/liquid chromatography/fluorescence detection［J］.Anal Chim Acta，2009，650(2):207－213

［6］Garcia L F，Aaron，J J.Flow injection analysis for the determination of thiabendazole and fuberidazole in water by spectrofluorimetry［J］.Mikrochim Acta，1997，126(3/4):289－294

［7］de Armas G，Miró M，Estela J M.Simultaneous determination of fluorophores with overlapped spectra by sequential injection analysis coupled to variable angle scanning fluorescence spectrometry and multivariate linear regression algorithms［J］.Anal Chim Acta，2002，471(2):173－186

［8］García Reyes J F，Llorent Martínez E J，Ortega Barrales P.Multiwavelength fluorescence based optosensor for simultaneous determination of fuberidazole，carbaryl and benomyl［J］.Talanta，2004，64(3):742－749

［9］Wu H L，Shibukawa M，Oguma K.An alternating trilinear decomposition algorithm with application to calibration of HPLC－DAD for simultaneous determination of overlapped chlorinated aromatic hydrocarbons［J］.J Chemometr，1998，12(1):1－26

［10］Damiani P C，Nepote A J，Bearzotti M，et al.A test field for the second－order advantage in bilinear least－squares and parallel factor analyses:Fluorescence determination of ciprofloxacin in human urine［J］.Anal Chem，2004，76(10):2798－2806

［11］Faber K，Kowalski B R.Net analyte signal calculation in multivariate calibration［J］.Anal Chem，1997，69(8):1620－1626

［12］Olivieri A C，Faber N M.Standard error of prediction in parallel factor analysis of three－way data［J］.Chemom Intell Lab Syst，2004，70(1):75－82

［13］Bro R，Kiers H A L.A new efficient method for determining the number of components in PARAFAC models［J］.J Chemometr，2003，17(5):274－286

［14］Nie J F，Wu H L，Zhu S H，et al.Simultaneous determination of 6－methylcoumarin and 7－methoxycoumarin in cosmetics using threedimensional excitation－emission matrix fluorescence coupled with second－order calibration methods［J］.Talanta，2008，75(5):1260－1269

［15］Arancibia J A，Escandar G M.Two different strategies for the fluorimetric determination of piroxicam in serum［J］.Talanta，2003，60(6):1113－1121

［16］González A G，Herrador M A，Asuero A G.Intra－laboratory testing of method accuracy from recovery assays［J］.Talanta，1999，48(3):729－736

RAPID DETERMINATION OF FUBERIDAZOLE IN AQUATIC ENVIRONMENTAL AND RIVER SEDIMENT SAMPLES USING THREE-DIMENSIONAL FLUORESCENCE COUPLED WITH SECOND-ORDER CALIBRATION METHOD

NIE Chongchong WU Hailong QING Xiangdong LI Yuanna LI Yong XU Hui ZHU Shaohua YU Ruqin
(State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，Hunan University，Changsha，410082，China)

Fuberidazole(FBZ)is one of the most important benzimidazole fungicides used in the field of agriculture.It persists in the environment after usage for a long time，which is a risk to human health and the environment.Therefore，it is important to quantify FBZ in the presence of complicated matrix background.A novel method has been proposed for the rapid determination of FBZ in environmental samples using three－dimensional fluorescence coupled with the second－order calibration method based on the alternating trilinear decomposition(ATLD)algorithm.When their component numbers were set to 2，the obtained average recoveries of FBZ in tap water，river water，pond water，rain water and river sediment samples were(100.5 ± 1.3)%、(93.8 ±1.1)%、(95.0 ±2.1)%、(98.2 ±2.3)%and(91.3 ±1.6)%，respectively.The limit of detection(LOD)was 0.58、1.38、4.47、5.60、0.43 pg·mL－1，respectively.Furthermore，the accuracy of the method was also evaluated through the elliptical joint confidence region(EJCR)tests as well as the figures of merit，such as sensitivity(SEN)，selectivity(SEL)and limit of quantification(LOQ).It showed that the proposed method could be used to directly determine fuberidazole contents even in the presence of unknown interferents and would provide a method for monitoring FBZ in the environment.

fuberidazole，three－dimensional fluorescence，second－order calibration，alternating trilinear decomposition，chemometrics.

2011年1月7日收稿.

*國家自然科學基金(20775025);國家科技部973預研項目(2007CB216404);國家教育部長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃項目資助.＊＊通訊聯(lián)系人，E－mail:hlwu@hnu.edu.cn