劉云霞 張 衛(wèi) 孫國新

(中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京，100085)

擬南芥體內(nèi)水楊酸對砷積累的影響*

劉云霞 張 衛(wèi) 孫國新＊＊

(中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京，100085)

采用擬南芥野生型和水楊酸合成缺失突變體sid2，對砷的積累進行了實驗研究.發(fā)現(xiàn)兩種擬南芥地上部對砷的積累都隨著砷暴露濃度的提高和暴露時間的延長而增加，但突變體sid2體內(nèi)的水楊酸含量低于野生型，其體內(nèi)積累的砷濃度明顯低于野生型;并且野生型體內(nèi)水楊酸含量與砷濃度存在顯著的線型關(guān)系(R2=0.76).可能是由于水楊酸參與了植物體內(nèi)砷的轉(zhuǎn)運或參與調(diào)節(jié)有關(guān)重金屬轉(zhuǎn)運和積累相關(guān)蛋白的合成，從而造成砷的積累.

擬南芥，砷，水楊酸，相關(guān)性.

水楊酸(salicylic acid，SA)作為一種小分子酚類信號物質(zhì)，廣泛存在于植物體中，是植物體內(nèi)普遍存在的內(nèi)源信號分子之一［1-3］.當植物受到環(huán)境脅迫，如干旱、寒冷、病毒侵害、鹽、重金屬等脅迫時，水楊酸就會發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)植物生理功能，提高自身對環(huán)境脅迫的抗性［4-8］.

砷作為一種致癌物質(zhì)，會導致人類皮膚、腎臟、肺以及膀胱癌的發(fā)病率明顯提高［9-10］.美國毒物和疾病登記署(ATSDR)公布的最具危險性有毒物質(zhì)中，砷排名第一位.由于砷和含砷礦山的開采、冶煉，含砷農(nóng)藥的使用，砷化合物作為養(yǎng)殖業(yè)飼料添加劑的廣泛使用，造成土壤中，特別是農(nóng)田中砷污染［11-13］.中國是受砷污染最為嚴重的國家之一，特別是我國中南部和西南部的湖南、云南、廣西、廣東等省區(qū).砷化合物被植物吸收，經(jīng)食物鏈進入人體，對人類健康造成嚴重威脅［14-16］.

植物(如擬南芥)在重(類)金屬如砷、鉛、汞、鎳、鎘等的脅迫下，體內(nèi)水楊酸含量會升高［1，17-20］.一些研究人員用擬南芥對砷的吸收、積累等方面進行了研究［21-22］，發(fā)現(xiàn)擬南芥暴露在高濃度砷中，體內(nèi)水楊酸升高［18］，對擬南芥的生長也有一定的抑制作用［23-24］.但到目前為止，水楊酸對植物砷吸收和積累的影響，以及擬南芥體內(nèi)水楊酸含量和積累的砷含量之間的關(guān)系仍未見報道.本文采用野生型和水楊酸含量減少的突變體的兩種擬南芥，對其吸收和積累砷以及與體內(nèi)水楊酸含量的關(guān)系進行了研究.以期為研究植物吸收砷的機制，以及水楊酸在植物吸收重(類)金屬中的作用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 擬南芥及培養(yǎng)方法

以模式植物擬南芥野生型(Wild Type，WT)和水楊酸含量減少的突變體(SA induction-deficient，sid2)兩種類型作為供試材料［25-26］.兩種擬南芥在蛭石和花土(1∶1混合)的介質(zhì)上生長.置于平底托盤上，放在光照培養(yǎng)箱中(MLR-351H sanyo，Japan)培養(yǎng).培養(yǎng)條件如下:溫度22℃;相對濕度70%;16 h光/8 h暗;光照強度250 μE·m－2·s－1.

生長1個月后，將擬南芥移入營養(yǎng)液中［27］，開始對其進行砷處理.在營養(yǎng)液中五價砷(Na3AsO4)最終濃度分別為 0、75、150、300 μmol·L－1，每3 d 換一次營養(yǎng)液，每2、4、6 d 取地上部，用超純水清洗干凈，放入－80℃冰箱冷凍儲存待用.

1.2 總砷樣品的制備及檢測

將收獲已于－80℃冷凍的植物樣品分出部分(4棵相同處理條件下的擬南芥混合成1個樣品，每個處理3個重復)，去離子水洗凈，擦干后稱量并記錄鮮重.將地上部剪下置于烘箱(70℃)中烘至恒重.烘干樣品置于50 mL塑料離心管中，每管加2 mL濃硝酸(優(yōu)級純)，放置過夜;之后在微波消煮爐(MARS，Matthew Inc.，USA)中進行微波輔助消解，消解程序參照文獻［28］.簡述如下:先在10 min內(nèi)溫度緩慢升至55℃，保持10 min;然后在10 min內(nèi)升至75℃，保持10 min;最后在10 min內(nèi)溫度升到95℃，保持30 min.冷卻后取出，用雙蒸蒸餾水稀釋至50 mL，混勻，等待檢測.

標準物質(zhì)(灌木枝葉，GBW 07603，地礦部物化探研究所)采用相同的方法，與樣品同步進行.消解后樣品用超純水稀釋至50 mL，待測.

砷含量采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)(7500cs型，安捷倫科技有限公司)進行檢測［28］，銦(In)(m/z 114)作為內(nèi)標檢測儀器運行中的穩(wěn)定性，同時檢測m/z 77、78、82，以確認是否存在生成的Ar40Cl35干擾物，干擾砷的測定.在所有檢測過程中，未發(fā)現(xiàn)存在干擾.

1.3 水楊酸的樣品制備及檢測

稱取0.5 g新鮮植物樣品，在研缽中用液氮研磨成勻漿，用1 mL甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，漩渦混合器振蕩1 min.在4℃下離心(10000×g)15 min，取上清液，在氮吹儀上吹干.加入0.25 mL的三氯乙酸(5%)溶解，振蕩2 min.加入0.8 mL乙酸乙酯與環(huán)己烷的混合液(1∶1，V/V)萃取2次，轉(zhuǎn)移上層有機相至新的離心管中，將上層有機相氮氣吹干，溶解在0.6 mL的液相流動相中.下層水相中加入0.3 mL鹽酸(8 mol·L－1)，搖勻，密閉，80℃恒溫水浴加熱1 h，使結(jié)合態(tài)SA轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)SA.加入相同的萃取劑萃取，氮氣吹干，溶解在0.6 mL液相流動相中.過0.45 μm濾膜，置于4℃保存，待測.

水楊酸采用高效液相色譜法(HPLC)(Waters 1525)檢測［2］.色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(250 mm× 4.6 mm，3.5 μm);流動相以90%的乙酸鈉(0.2 mol·L－1，pH 5.5)為水相，以HPLC 級甲醇(10%)為有機相，熒光檢測器的激發(fā)波長為294 nm，發(fā)射波長為426 nm，流動相流速為0.5 mL·min－1，進樣體積為10 mL.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度的砷對擬南芥生長的影響

不同砷濃度下兩種擬南芥的鮮重變化見圖1，與對照(未加砷)相比，兩種類型擬南芥WT、sid2在75和150 μmol·L－1生長都未受到抑制，而 300 μmol·L－1中兩種擬南芥鮮重減少了大約 30%，說明高濃度砷(300 μmol·L－1)對兩種擬南芥均產(chǎn)生了明顯的抑制作用，但品種間沒有差別.高濃度砷對植物有一定毒害作用［29］.Lee等報道在培養(yǎng)基中添加250 μmol·L－1的As(Ⅴ)，野生型擬南芥的生長被抑制了大約20%，與本文的結(jié)果一致［4］.其它研究也發(fā)現(xiàn)，高濃度的As(Ⅴ)對擬南芥的生長和根長都有一定的抑制作用［23-24］.

圖1 不同砷濃度下兩種擬南芥的鮮重(sid2:擬南芥SA突變體;WT:野生型)Fig.1 Fresh weight of two types of Arabidopsis under different As treatment

2.2 擬南芥體內(nèi)水楊酸的積累

較高濃度的砷對擬南芥來說是一種環(huán)境脅迫，而這樣的環(huán)境脅迫會造成植物的防衛(wèi)反應，導致水楊酸的合成.因為sid2為水楊酸合成突變體，即水楊酸合成功能缺失，首先檢測在砷脅迫下，兩種擬南芥體內(nèi)水楊酸的積累情況.如圖2顯示，對于野生型(WT)，隨著培養(yǎng)基砷濃度增加地上部SA的積累量也逐漸增加.Krantev等人觀察到，在Cd脅迫下玉米中SA的含量遠高于未做任何處理的對照［5］，其它研究也發(fā)現(xiàn)Cd、Pb的暴露增加了植物中水楊酸的含量［19，17］，暗示增加的SA可能與植物降低體內(nèi)重(類)金屬的毒性有關(guān).據(jù)Freeman等人報道，在Ni的脅迫下，升高的水楊酸含量可以激發(fā)絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，從而提高擬南芥體內(nèi)谷胱甘肽的含量，進而增加其對Ni的抗性［20］.砷作為一種類金屬，其造成的脅迫作用與Ni相似，推測由于砷濃度增加，砷對擬南芥的脅迫也增強，植物為了增強其對As的抗性，會合成更多的水楊酸.

但隨著砷暴露時間的延長，SA的積累并不是一直增加，與暴露2 d相比，暴露4 d SA的積累相應增加，但暴露6d體內(nèi)水楊酸含量明顯降低.這可能是因為砷暴露時間過長，對植物產(chǎn)生了毒性傷害，從而降低了水楊酸的合成.而sid2體內(nèi)水楊酸的含量遠低于相應的野生型擬南芥.因為該擬南芥為水楊酸合成缺失株，合成水楊酸的能力很差.對于暴露在不同的砷濃度和不同的時間，地上部水楊酸的含量沒有明顯的差別(圖2)，在 0.21—0.54 mg·kg－1范圍內(nèi)變化.

2.3 砷濃度和暴露時間對擬南芥地上部砷積累的影響

為了考察不同的擬南芥對砷的積累，檢測了擬南芥地上部中的砷含量.無論是WT還是sid2，體內(nèi)積累的砷都隨著營養(yǎng)液中砷濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長而增加(圖3).在野生型中，當培養(yǎng)基中As達到300 μmol·L－1時，培養(yǎng)2 d As濃度為14.6 mg·kg－1，培養(yǎng)6 d 砷積累達到了53.4 mg·kg－1.Dhankher等人用擬南芥在 100 μmol·L－1As(Ⅴ)的培養(yǎng)基中暴露 3 周，地上部砷積累濃度約為40 mg·kg－1［24］.因添加砷的濃度不同，暴露時間也不相同，而這兩個因素是造成擬南芥體內(nèi)砷積累的主要因素，所以不同的文獻之間擬南芥對砷的積累也不盡相同.可以肯定，野生型擬南芥對砷有一定的耐受和積累能力.

對于水楊酸合成突變株sid2，與野生型相似，營養(yǎng)液中砷的濃度和暴露時間對其體內(nèi)的砷濃度有很大影響，隨著培養(yǎng)時間的延長和砷濃度的增加而增加.但與野生型相比，sid2地上部積累的砷濃度要低得多(圖3).例如在 300 μmol·L－1As(Ⅴ)中暴露6 d，sid2 中砷的積累同樣達到最大值23.4 mg·kg－1，但這只是對應的野生型WT中砷積累量的44%，明顯低于野生型對砷的積累.因為sid2突變體是由于植物體內(nèi)產(chǎn)生水楊酸所需基因ics的缺失，導致水楊酸合成路徑受阻礙，引起體內(nèi)水楊酸含量減少的一種突變體［25-26］.砷積累減少可能與SA合成有關(guān).但具體原因仍不清楚，需進一步研究.這是首次采用水楊酸合成缺陷的擬南芥研究其對砷的積累，發(fā)現(xiàn)其積累能力遠低于野生型.

圖2 在不同濃度As(Ⅴ)和不同暴露時間下擬南芥地上部水楊酸的積累Fig.2 The accumulation of SA in the shoots of Arabidopsis with the addition of As(Ⅴ)concentration at 0，75，150，300 μmol·L －1in the culture medium

圖3 營養(yǎng)液中砷濃度和暴露時間對擬南芥地上部砷積累的影響Fig.3 The effect of As concentration(0，75，150，300 μmol·L －1)in culture medium and exposure time on As accumulation in the shoots of Arabidopsis(WT and sid2)

2.4 水楊酸濃度與積累的砷濃度相關(guān)性

在野生型擬南芥的地上部中，砷的積累量與水楊酸濃度呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(圖4).隨著砷積累濃度的提高，體內(nèi)水楊酸含量也逐漸增加，其相關(guān)系數(shù)R2達到了0.7567，顯示了較好的相關(guān)性.據(jù)報道，水楊酸與重金屬在體外可以形成復雜化合物［27］，但這一過程沒有在植物體內(nèi)被證實.可能的原因是，水楊酸參與了植物體內(nèi)重金屬的運輸和積累;或者水楊酸作為一種信號分子，參與調(diào)節(jié)有關(guān)重金屬轉(zhuǎn)運和積累相關(guān)蛋白的合成.體內(nèi)水楊酸合成增加，合成的相關(guān)蛋白也增加，并呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，從而與地上部砷的積累也呈現(xiàn)相關(guān)性.而在水楊酸合成缺失株sid2中，則沒有顯示出相關(guān)性，可能是因為水楊酸合成的缺失，造成體內(nèi)水楊酸含量的減少，重金屬轉(zhuǎn)運或積累相關(guān)蛋白合成也降低，從而抑制了擬南芥對砷的吸收和積累，造成擬南芥對砷積累的降低(圖2、3).

圖4 擬南芥地上部水楊酸濃度與積累的砷濃度相關(guān)性Fig.4 The relationship between SA concentration and accumulated As in the Arabidopsis shoots

3 結(jié)論

擬南芥野生型在As(Ⅴ)脅迫下，地上部體內(nèi)水楊酸的含量隨As(Ⅴ)濃度的提高和暴露時間的延長而增加，但水楊酸合成突變體sid2中水楊酸含量很低，并保持恒定.而二者體內(nèi)砷含量均隨As(Ⅴ)濃度提高和暴露時間的延長而增加，雖然sid2中砷的濃度比野生型中砷濃度低很多.在野生型擬南芥中，砷的濃度與水楊酸含量之間存在明顯的線性關(guān)系，說明水楊酸可能參與了砷的轉(zhuǎn)運或參與調(diào)節(jié)有關(guān)重金屬轉(zhuǎn)運和積累相關(guān)蛋白的合成.

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THE EFFECT OF SALICYLIC ACID ON ARSENIC ACCUMULATION IN ARABIDOPSIS

LIU Yunxia ZHANG Wei SUN Guoxin
(Research Center for Eco-Environmental Sciences，Chinese Academy of Sciences，Beijing，100085，China)

Salicylic acid plays an important role against metal/metalloid stress to plant.As accumulation in Arabidopsis was investigated by wild type and sid2(salicylic acid induction deficient).Results showed that As accumulation in shoots was increased in both types of Arabidopsis with the increase of exposed As concentration and exposure time.The contents of salicylic acid in sid2 were much lower than those of corresponding wild type and As levels in sid2 were lower than those in the wild type as well.The significant linear relationship(R2=0.76)was observed in this investigation.Probably salicylic acid was involved in the As translocation in plants or in the synthesis of proteins for transferring or accumulating As in plants，which cause As accumulation in the shoots of plants.

Arabidopsis，arsenic，salicylic acid，relationship.

2011年5月13日收稿.

*國家自然科學基金項目(40973058);國家水體污染控制與治理科技重大專項(2009ZX07212-001-05)資助.

＊＊通訊聯(lián)系人，E-mail:gxsun@rcees.ac.cn