鄭 麗，王 昕，王景會，楊貞耐，，*

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長春130024; 2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林長春130033)

微小毛霉凝乳酶基因在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)研究

鄭 麗1，王 昕1，王景會2，楊貞耐1，2，*

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長春130024; 2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林長春130033)

目的:研究重組畢赤酵母GS115PJ5誘導(dǎo)表達(dá)微小毛霉凝乳酶過程中酵母生長、產(chǎn)酶及培養(yǎng)液總蛋白變化情況。方法:測定畢赤酵母生長曲線、凝乳酶凝乳活性、蛋白水解活性、培養(yǎng)基上清液總蛋白含量。結(jié)果:畢赤酵母在開始誘導(dǎo)24h后即進(jìn)入穩(wěn)定生長期，并保持到240h，然后進(jìn)入衰亡期。SDS-PAGE顯示在分子量約為47000處有目的凝乳酶條帶，凝乳酶在培養(yǎng)144h后開始大量積累，酶活性迅速提高，192h時凝乳活性達(dá)到最大值300SU/mL，蛋白水解活性為10.75U/mL，凝乳活性與蛋白水解活性的比值(C/P)達(dá)到最大值27.9，上清液總蛋白含量為0.189mg/mL。結(jié)論:微小毛霉凝乳酶基因在畢赤酵母中得到了有效的表達(dá)。

微小毛霉凝乳酶，巴斯德畢赤酵母，表達(dá)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組巴斯德畢赤酵母菌株GS115PJ5(基因組中整合有微小毛霉凝乳酶基因) 由本實驗室構(gòu)建獲得;YPD BMGY BMMY培養(yǎng)基組成和配制 見Invitrogen公司畢赤酵母培養(yǎng)手冊。

全自動凝膠成像系統(tǒng) AlphaImager HP;蛋白電泳設(shè)備 Bio-rad Mini-Protean;臺式離心機(jī)Eppendorf 5415D;紫外可見分光光度計 Varian Cary 300;高速冷凍離心機(jī) Thermo Sorvall Evolution RC; -80℃超低溫冰箱 Thermo Electron 705;顯微鏡圖像處理系統(tǒng) BX51+DP71;全溫振蕩培養(yǎng)箱 HZQ -X100;高壓蒸汽滅菌器 MLS-3780。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá) 將重組畢赤酵母GS115PJ5接種于 YPD固體培養(yǎng)基中，劃線分離，30℃培養(yǎng)2d，挑取單菌落接種于裝有50mLBMGY培養(yǎng)基并經(jīng)過滅菌的500mL三角瓶中，30℃、260r/min培養(yǎng)24～32h，至OD600達(dá)到2.0～6.0。鏡檢確保菌株沒有染菌。將培養(yǎng)基于4℃、6000r/min離心5min，棄去上清，收集菌體，懸浮于100mL BMMY培養(yǎng)基中，使其OD600值達(dá)到2.0左右。用雙層封口膜封口，于30℃、260r/min的搖床上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇，至最終濃度為1%。每24h取樣測定所產(chǎn)凝乳酶的凝乳活性、蛋白水解活性和總蛋白含量。并于培養(yǎng)結(jié)束后鏡檢確定誘導(dǎo)過程中沒有染菌。

1.2.2 重組畢赤酵母生長曲線測定

1.2.2.1 總菌數(shù) 每24h取樣檢測菌液的OD600，直至培養(yǎng)結(jié)束。

1.2.2.2 活菌數(shù) 每24h取樣，用0.9%生理鹽水將菌液稀釋至適當(dāng)濃度，涂布于YPD固體平板，30℃培養(yǎng)48h，記錄平板的菌落數(shù)。每個樣品做3個平行，取平均值。

1.2.3 凝乳酶酶活測定 將重組酵母培養(yǎng)液10000r/min，離心1min，棄去菌體，測定上清液的各項指標(biāo)。

凝乳酶酶活的測定采用改進(jìn)的Arima K［9］方法: 0.01mol/L CaCl2溶液配制10%脫脂乳，吸取35℃下保溫10min的脫脂乳溶液1mL加入試管，加入0.1mL凝乳酶上清液，迅速振蕩搖勻，開始計時，當(dāng)試管壁出現(xiàn)凝集小顆粒計時終止。凝乳活性定義:40min凝集1mL 10%脫脂乳的酶量定義為一個活力單位SU。

凝乳酶活力(SU)=(供試乳數(shù)量/凝乳酶量)× 2400/t×n

其中:n-稀釋倍數(shù):t-凝乳時間。

1.2.4 凝乳酶蛋白水解活力檢測 凝乳酶蛋白水解活力檢測采用中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T10317 -1999蛋白酶水解活力測定方法［10］:取試管，每管加入樣品稀釋液1mL，置于40℃水浴中預(yù)熱2min，各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1mL，精確保溫10min，時間到后，立即各加入0.4mol/L三氯乙酸2mL，終止反應(yīng)，繼續(xù)置于水浴中保溫20min，殘余蛋白質(zhì)沉淀離心后，取試管，每管內(nèi)加入濾液1mL，再加0.4mol/L碳酸鈉5mL，0.7mol/L的福林試劑1mL，搖勻，40℃保溫發(fā)色20min后進(jìn)行OD680測定?？瞻讟悠?，測定同上，加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。

式中:OD680-680nm波長下，樣品與空白實驗的讀數(shù)差;K-常數(shù)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出，數(shù)值上等于OD680為1時相當(dāng)?shù)睦野彼岬奈⒖藬?shù);V-反應(yīng)液體積;T-反應(yīng)時間(10min)。

1.2.5 重組畢赤酵母發(fā)酵液中總蛋白含量測定 總蛋白含量測定采用Bradford法［11］:標(biāo)準(zhǔn)曲線以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制。加入適當(dāng)體積的樣品，加入0.15mol/L NaCl溶液補(bǔ)足至0.1mL。各試管中加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250，每加完一管立即在漩渦振蕩器上混勻。加完試劑2min后即可在OD595下比色。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

取發(fā)酵 72h和192h上清液加入 2×Loading Buffer蛋白上樣液，95℃加熱 5min后上樣。SDSPAGE電泳結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，在發(fā)酵72h的上清液中已有分子量約47000的重組蛋白條帶，說明微小毛霉凝乳酶在重組菌中得到了表達(dá)。并且隨著培養(yǎng)時間增加到192h時，目的蛋白酶的條帶加重，說明目的蛋白的表達(dá)量在逐步增加。

圖1 重組畢赤酵母GS115PJ5上清液SDS-PAGE檢測注:M:蛋白marker;1:72h上清液;2:192h上清液。

2.2 重組畢赤酵母的生長曲線測定

實驗結(jié)果如圖2所示，在酶的誘導(dǎo)表達(dá)過程中，重組畢赤酵母生長狀況良好。開始誘導(dǎo)表達(dá)時的OD600為1.93，經(jīng)過24h的誘導(dǎo)達(dá)到菌體OD600為2.83，進(jìn)入穩(wěn)定生長期。至216h總菌數(shù)與活菌數(shù)均達(dá)到最大值，之后總菌數(shù)基本保持不變，而活菌數(shù)開始急劇減少，240h時活菌數(shù)為穩(wěn)定生長期活菌數(shù)的50%，312h時活菌數(shù)僅為穩(wěn)定生長期的25%左右。

2.3 重組畢赤酵母產(chǎn)凝乳酶的凝乳活性曲線測定

在凝乳酶誘導(dǎo)表達(dá)過程中凝乳活性變化情況如圖3所示，誘導(dǎo)48h之后隨著培養(yǎng)時間的增加，凝乳活性也快速提高。至192h達(dá)到最大值，然后活力逐步下降，可能由于菌體自溶或產(chǎn)生其他雜蛋白將凝乳酶水解所致。該結(jié)果與圖2畢赤酵母在216h后開始進(jìn)入衰亡期結(jié)果相一致。

圖2 重組畢赤酵母GS115PJ5生長曲線

圖3 重組畢赤酵母GS115PJ5產(chǎn)凝乳酶酶活曲線

2.4 重組畢赤酵母產(chǎn)凝乳酶的蛋白水解活性曲線測定

如圖4(a)所示，隨著培養(yǎng)時間的增加蛋白水解活性也逐步上升，但上升幅度較小，在192h之后蛋白水解活性開始明顯上升，可能由于菌體進(jìn)入衰亡期，各種雜質(zhì)的產(chǎn)生對重組蛋白水解活性有較大的影響。圖4(b)為蛋白水解活性測定用酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0101x+0.0070;相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，K值為98.32。

圖4 (a) 重組畢赤酵母GS115PJ5產(chǎn)凝乳酶蛋白水解活性曲線

圖4 (b) 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 重組畢赤酵母總蛋白含量測定

如圖5(a)所示，培養(yǎng)液總蛋白含量在培養(yǎng)初期緩慢增長，經(jīng)過168h培養(yǎng)后有明顯上升趨勢，但凝乳酶酶活并沒有顯著提高(圖3)，說明在誘導(dǎo)后期總蛋白含量的增加，并不能進(jìn)一步增加凝乳酶活力，可能是菌體破裂后胞內(nèi)蛋白溶出或是進(jìn)入衰亡期的菌體產(chǎn)生的其他蛋白組分所致。圖5(b)為總蛋白含量測定用標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0074x-0.0037，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9999。

圖5 (a) 重組畢赤酵母GS115PJ5上清液總蛋白含量測定曲線

圖5 (b) 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 重組畢赤酵母產(chǎn)凝乳酶綜合評價

通過上述對重組畢赤酵母在誘導(dǎo)表達(dá)過程中不同時間培養(yǎng)液的連續(xù)取樣測定分析，表明重組酵母菌在誘導(dǎo)表達(dá)開始后48h即出現(xiàn)較高的酶活，隨著培養(yǎng)時間的增加，總蛋白含量穩(wěn)步增加，凝乳活性和水解活性也相應(yīng)提高，培養(yǎng)144h后凝乳活性相對于水解活性和總蛋白含量增加幅度較大。如圖6所示，凝乳活性和蛋白水解活性比值，即C/P在144h后上升幅度較大，在培養(yǎng)168h和192h時達(dá)到最大值約27，而192h凝乳活性達(dá)到最大值(圖3)，因此可以考慮在192h時結(jié)束誘導(dǎo)。

圖6 重組畢赤酵母GS115PJ5產(chǎn)凝乳酶C/P值

3 討論

本研究通過對重組畢赤酵母GS115PJ5誘導(dǎo)表達(dá)凝乳酶的分析表明，畢赤酵母培養(yǎng)24h后進(jìn)入穩(wěn)定期，216h后進(jìn)入衰亡期，菌體數(shù)量急劇減少，細(xì)胞開始自溶。誘導(dǎo)192h后酶活可達(dá)300SU/mL，蛋白水解活性為10.75U/mL，總蛋白含量為0.189mg/mL，C/P達(dá)27.9，所產(chǎn)凝乳酶分子量約為47000。

重組畢赤酵母GS115PJ5表達(dá)的凝乳酶屬于胞外分泌型，所表達(dá)的酶直接分泌到培養(yǎng)基中，可通過離心將菌體除去后獲得粗酶液，不必經(jīng)過細(xì)胞破壁等過程，大大地減少了提純的工作量，減少了雜質(zhì)對凝乳酶活性的影響。同時，畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)物的積累不會對自身產(chǎn)生毒副作用，通過大批量高密度培養(yǎng)可使酶的產(chǎn)量較搖瓶培養(yǎng)提高十幾到幾十倍，適于酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

本研究通過畢赤酵母表達(dá)所得凝乳酶的產(chǎn)量較丘重晏［12］和本實驗室采用9K載體在畢赤酵母中表達(dá)的酶量分別高50倍和15倍［13］。同時，本研究所獲得的重組畢赤酵母GS115PJ5的生長曲線和酶活曲線與張莉［14］報道的產(chǎn)牛凝乳酶的重組畢赤酵母GS115相一致。通過SDS-PAGE電泳可知，本研究采用重組畢赤酵母GS115PJ5表達(dá)的產(chǎn)物中雜蛋白較少，與野生微小毛霉產(chǎn)生的凝乳酶相比，前者菌體產(chǎn)酶相對單一，為酶的提純提供了便利條件。

［1］張國農(nóng).乳制品生產(chǎn)技術(shù)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2002:388.

［2］閆美麗.干酪在中國的發(fā)展?jié)摿Γ跩］.中國食品與營養(yǎng)，2005(3):19.

［3］董暮螢，任發(fā)政.世界干酪文化鑒賞［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004:192-198.

［4］Ematage JS，Angal S，Doel MT，et al.Synthesis of calf Prochymosin(Pro-rennin)in Escherichia Coli［J］.Biochemistry，1983，80:3671-3675.

［5］Goffer CG，Moir DT，Gravius TC，et al.Expression of Calf Prochymosin in Saccharomyces Cerevisae，Gene［J］.1984，27(1): 35-46.

［6］Thames P.Biotechnological Innovation in Food Processing［M］.England:Butterworth-Heineman Ltd，1991:113-145.

［7］于平.巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展［J］.工業(yè)微生物，2005，35(3):50-54.

［8］Cereghino JL，Cregg JM.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris［J］.FEMS Microbiology Reviews，2000，24(1):46-53.

［9］Arima K，Yu J，Iwasaki S，et al.Milk-clotting Enzyme from Microorganisms:V.Purification and Crystallization ofMucor Rennin from Mucor pusillus var.Lindt［J］.Applied Microbiology，1968，16(11):1727-1733.

［10］SB/T 10317-1999.蛋白酶活力測定法［S］.

［11］汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊［M］.北京:科學(xué)出版社，2000:42-46.

［12］張麗紅.微小毛霉凝乳酶及其重組酶的產(chǎn)酶條件和酶學(xué)特性的研究［D］.吉林大學(xué)，2009:35.

［13］丘重晏，徐敏，王正祥.凝乳酶的基因克隆序列分析及初步表達(dá)［J］.食品科學(xué)，2005(7):58-62.

［14］張莉，姜媛媛，張健，等.牛凝乳酶基因在畢赤酵母中的重組表達(dá)［J］.食品生物技術(shù)，2009，25(8):1160-1165.

Study on induced expression of the rennin gene of Mucor pusillus by Pichia pastoris

ZHENG Li1，WANG Xin1，WANG Jing-hui2，YANG Zhen-nai1，2，*
(1.College of Biological and Agricultural Engineering，Jilin University，Changchun 130024，China; 2.Jilin Academy of Agricultural Sciences，Center of Agro-food Technology，Changchun 130033，China)

Objectives:To study the growth，enzyme-producing properties of the yeast and total protein of cultures during the induced expression of Mucor pusillus rennin in recombinant Pichia pastoris GS115PJ5.Method:Growth curve，milk-clotting activity，proteolytic activity，total protein content were determined.Results:The results showed that the yeast entered the stationary phase after incubation for 24h，and started to enter the decline phase after 240h.A strong band at about 47000 was shown by SDS-PAGE.Analysis of enzymatic activity showed that rennin accumulated rapidly after incubation for 144h and reached the maximum milk-clotting activity(300SU/mL)at 192h. Proteolytic activity，the ratio of milk-clotting activity and proteolytic activity(C/P)and total protein content were determined to be 10.75U/mL，27.9，0.189mg/mL，respectively.Conclusion:Mucor pusillus rennin was expressed effectively in Pichia pastoris.

Mucor pusillus rennin;Pichia pastoris;expression

Q786

A

1002-0306(2011)07-0178-04

干酪是牛乳經(jīng)凝乳處理、排乳清和壓榨等加工而成的產(chǎn)品，其中含有大量必需氨基酸、豐富的鹽類、維生素A等營養(yǎng)成分。同時，食用干酪還具有緩解乳糖不耐癥，平衡腸道菌群，護(hù)肝抗癌的功效［1］。隨著經(jīng)濟(jì)和貿(mào)易的全球化，干酪生產(chǎn)被認(rèn)為是當(dāng)今我國乳品業(yè)發(fā)展新的增長點，其必將成為未來我國乳品工業(yè)的主要產(chǎn)品之一［2］。凝乳酶是干酪加工過程中的必需酶，主要作用包括兩個方面:一是使牛乳凝結(jié)，二是在成熟過程中改善風(fēng)味。傳統(tǒng)的凝乳酶來源于小牛皺胃，由于全球性的小牛短缺使其來源變得不穩(wěn)定。基因工程生產(chǎn)的重組凝乳酶已成為食品加工業(yè)中最先使用的重組酶產(chǎn)品之一。世界上已有美、英、意、德等19個國家能夠生產(chǎn)基因工程凝乳酶［3］。目前我國干酪生產(chǎn)所用的凝乳酶以進(jìn)口為主，成本較高，凝乳酶缺乏已成為制約我國乳品工業(yè)干酪生產(chǎn)的重要因素。據(jù)報道，凝乳酶基因已經(jīng)在大腸桿菌［4］、酵母菌［5］、黑曲毛霉［6］等宿主菌中表達(dá)。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近幾年來新興的基因工程表達(dá)系統(tǒng)，因其具有高表達(dá)、高穩(wěn)定、高分泌、容易放大、成本低等［7］多項優(yōu)點，已被廣泛用于表達(dá)多種蛋白［8］。另外，由于用于誘導(dǎo)的甲醇的易揮性使得其在酵母培養(yǎng)及制備凝乳酶制劑的過程中揮發(fā)殆盡，不會影響到該重組酶在干酪加工中的應(yīng)用。本實驗研究了微小毛霉凝乳酶基因在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)，對其生長和產(chǎn)酶特性進(jìn)行研究，為基因工程凝乳酶的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

2010-06-07 *通訊聯(lián)系人

鄭麗(1985-)，女，碩士研究生，研究方向:食品生物技術(shù)。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2006AA10Z306);農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助項目(nycytx -0502)。