蔡國林，金 昭，陸 健，*

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122; 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122)

啤酒生產(chǎn)過程中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的控制研究

蔡國林1，2，金 昭2，陸 健1，2，*

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122; 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122)

以感染鐮孢霉屬真菌的大麥為原料，確定了NaHSO3溶液浸泡的化學(xué)脫毒方法(浸泡濃度為10g/L和浸泡時(shí)間為50min)和在第一次浸麥階段接種白地霉孢子106個(gè)/g大麥的微生物脫毒方法，并對(duì)比研究了兩種脫毒方法的效果。對(duì)制麥和釀造過程中DON變化及相關(guān)理化指標(biāo)的比較發(fā)現(xiàn)，添加白地霉G4的脫毒效果較NaHSO3溶液浸泡好，而采用NaHSO3溶液浸泡處理方法所制得的麥芽、麥汁和啤酒的理化指標(biāo)相對(duì)較好。兩種脫毒方式所制得的麥芽的理化指標(biāo)均符合QB/T1686-2008中啤酒麥芽的要求，成品啤酒的常規(guī)理化指標(biāo)均符合GB 4927-2008中淡色啤酒的理化要求。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，真菌毒素，啤酒，控制

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白地霉 分離自大麥表面，由本研究室保藏; PDA培養(yǎng)基 取去皮馬鈴薯200g，切塊，加1000mL蒸餾水，煮沸20min后用紗布過濾，補(bǔ)加蒸餾水至1000mL，加入葡萄糖 20g，分裝，121℃高壓滅菌20min;5°P麥汁培養(yǎng)基 取糖化麥汁，加蒸餾水適量，稀釋成5°P，分裝，108℃滅菌20min;大麥原料經(jīng)過挑選的感染鐮孢霉屬真菌的2008年度某農(nóng)民散種大麥;甲醇 色譜純，購自江蘇漢邦科技有限公司;乙腈 色譜純，購自 Fisher Chemicals公司; Whatman 4號(hào)定性濾紙 購自上海摩速科學(xué)器材有限公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純;PuriToxSR嘔吐毒素專用凈化柱 購自北京銳鑫農(nóng)科貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白地霉菌株培養(yǎng)條件 白地霉菌株4℃保藏，使用前，連續(xù)兩次轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，轉(zhuǎn)接至5°P麥芽汁平板上，28℃培養(yǎng)過夜，取一環(huán)菌種，加入25mL 5°P麥芽汁培養(yǎng)基中，于28℃、180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48h。調(diào)整菌體濃度為107cfu/mL，用于實(shí)驗(yàn)接種。

1.2.2 制麥工藝 浸麥前洗麥兩次，浸麥:浸麥6h，斷水12h，浸麥2h，斷水8h，浸麥2h，共30h，浸麥溫度15℃;發(fā)芽:15℃發(fā)芽4d，濕度控制在90%;焙燥: 40℃ 14h，75℃ 3h，85℃ 3h。

1.2.3 糖化和發(fā)酵工藝 糖化和發(fā)酵工藝曲線見圖1，70℃60min后煮沸麥汁，煮沸時(shí)間為40min，煮沸10min時(shí)添加酒花，酒花添加量0.003%。發(fā)酵所用麥汁為全麥芽麥汁。

圖1 糖化工藝曲線(A)和發(fā)酵工藝曲線(B)

1.2.4 NaHSO3浸泡去除DON 以感染赤霉病的江蘇產(chǎn)散戶大麥為原料，浸泡大麥所用NaHSO3溶液的體積為大麥重量的2～3倍，通過霉菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)及發(fā)芽率測(cè)定來確定NaHSO3溶液的濃度和浸泡時(shí)間。NaHSO3溶液浸泡后的大麥按1.2.2工藝進(jìn)行制麥。

1.2.5 微生物去除DON 除了在第一次浸麥水中添加一定濃度的白地霉孢子外，其它工藝按1.2.2進(jìn)行。

1.3 分析方法

HPLC方法檢測(cè)大麥、麥芽和啤酒中的DON［14］，大麥或麥芽中DON的檢測(cè)限為0.03mg/kg，啤酒中DON的檢測(cè)限為0.4μg/L;麥芽、麥汁和啤酒常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定:按文獻(xiàn)［15-16］中方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 NaHSO3溶液濃度和浸泡時(shí)間的選擇

DON是鐮孢霉屬真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，通過清洗大麥上的霉菌可以減少發(fā)芽過程中DON的產(chǎn)生。NaHSO3不僅可以和DON形成DON磺酸鹽，還可以有效地清洗大麥表面的霉菌。不同濃度和浸泡時(shí)間對(duì)大麥表面霉菌的清洗效果和發(fā)芽率影響如表1所示。從表1可知，隨著NaHSO3濃度的增加和浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，大麥表面霉菌的清洗效果有所提高，同時(shí)發(fā)芽率有所降低。當(dāng)采用濃度為10g/L的NaHSO3溶液浸泡50min時(shí)，大麥表面霉菌的清洗效果較好，且對(duì)發(fā)芽率的影響較小。

表1 NaHSO3溶液濃度和浸泡時(shí)間對(duì)霉菌清洗效果和發(fā)芽率的影響

2.2 白地霉添加量的選擇

微生物脫毒主要通過競(jìng)爭(zhēng)作用，抑制其它霉菌的生長(zhǎng)，尤其是鐮孢霉屬真菌。表2反映了白地霉不同添加量的脫毒效果。從表2可知，添加白地霉對(duì)大麥的發(fā)芽率基本上沒有影響，但對(duì)發(fā)芽的整齊度有所提高。當(dāng)白地霉的添加量為106個(gè)/g大麥和107個(gè)/g大麥時(shí)，成品麥芽中都檢測(cè)不到DON，但考慮到白地霉生長(zhǎng)繁殖快，如果接種量過大，有可能對(duì)麥芽和啤酒的品質(zhì)產(chǎn)生不利的影響。因此，選用106個(gè)/g大麥的接種量。

表2 第一次浸麥時(shí)添加不同量的白地霉所制的麥芽中DON含量

2.3 制麥過程中DON變化的比較

不同脫毒方式制麥過程中的DON變化情況如圖2所示。從圖2可以看出，對(duì)于未經(jīng)任何處理的大麥，DON含量經(jīng)歷了一個(gè)先減少后增加的過程，最終成品麥芽中DON約為原大麥的57%，這與Schwarz等人的研究結(jié)果相似［5］。這是因?yàn)镈ON具有水溶性，浸麥可以去除部分DON和鐮孢霉屬真菌，而在浸麥和發(fā)芽初期，大麥內(nèi)部未被洗掉的鐮孢霉屬真菌孢子重新萌發(fā)、生長(zhǎng)、代謝，再次產(chǎn)生并積累DON。而采用10g/L的NaHSO3溶液浸泡50min可以去除大麥的全部DON，且在制麥過程中重新生成的DON含量也相對(duì)減少，最終成品麥芽中的DON含量約為原大麥的13%。接種白地霉的大麥在浸麥結(jié)束時(shí)，檢測(cè)到微量的DON(低于定量限)，但在發(fā)芽過程中、成品麥芽和麥根中均未檢測(cè)到DON，說明白地霉的生長(zhǎng)抑制了鐮孢霉屬真菌的生長(zhǎng)代謝，并最終影響DON的形成與積累。

圖2 NaHSO3浸泡和添加白地霉兩種方式脫毒效果的比較

2.4 不同脫毒方式麥芽品質(zhì)的比較

NaHSO3浸泡和添加白地霉兩種脫毒方式所制得麥芽的理化指標(biāo)如表3所示，兩種麥芽的理化指標(biāo)均符合QB/T1686-2008中的啤酒麥芽的要求。

表3 NaHSO3浸泡和添加白地霉兩種脫毒方式麥芽理化指標(biāo)的比較

從表3可知，相對(duì)于未經(jīng)處理的大麥所制得的麥芽，NaHSO3溶液浸泡處理的大麥所制得的麥芽的糖化力、色度和庫值等指標(biāo)比較優(yōu)良;接種白地霉所制麥芽的總氮和可溶性氮較高。在以前的研究中觀察到白地霉可以穿透大麥表皮，進(jìn)入到胚乳細(xì)胞壁間隙，麥芽中的總氮和可溶性氮較高可能與浸麥所接種的白地霉在制麥過程中大量生長(zhǎng)有關(guān)。

2.5 糖化和發(fā)酵過程中DON變化的比較

對(duì)兩種不同處理方式所制得的麥芽進(jìn)行了啤酒釀造實(shí)驗(yàn)，DON在釀造過程中的變化情況如表4所示，DON的回收率為每一環(huán)節(jié)結(jié)束后DON的總量與麥芽粉中DON總量之比。從表4可以看出，不同麥芽的DON含量在糖化和發(fā)酵過程中變化不大。采用NaHSO3溶液浸泡的脫毒方式可以使成品啤酒中的DON含量明顯降低，為對(duì)照樣品的26%，而添加白地霉的脫毒方式所釀造的啤酒中沒有檢測(cè)到DON。

表4 兩種脫毒方法所制麥芽在糖化和發(fā)酵過程中DON殘留情況的比較

2.6 啤酒品質(zhì)的比較

從表5可以看出，白地霉麥芽啤酒的發(fā)酵度和濁度高于對(duì)照麥芽啤酒，這應(yīng)該是由于白地霉麥芽的α-氨基氮高，糖化力強(qiáng)，發(fā)酵過程中的酵母代謝旺盛所致。兩種處理麥芽所制得啤酒中的色度相對(duì)較低，而NaHSO3溶液浸泡脫毒方式所制得啤酒的其他各項(xiàng)指標(biāo)均較好。采用NaHSO3溶液浸泡和白地霉制麥兩種脫毒方式所得啤酒的常規(guī)理化指標(biāo)均符合GB 4927-2008中淡色啤酒的理化要求。

表5 NaHSO3浸泡和添加白地霉兩種脫毒方式啤酒理化指標(biāo)的比較

3 結(jié)論

本文以感染鐮孢霉屬真菌的大麥為原料，對(duì)比研究了以NaHSO3溶液浸泡的化學(xué)脫毒方法和添加白地霉的微生物脫毒方法的效果。確定了NaHSO3溶液的濃度為10g/L和浸泡時(shí)間為50min;在第一次浸麥階段接種白地霉106個(gè)/g大麥。對(duì)制麥和釀造過程中DON變化及相關(guān)理化指標(biāo)的比較發(fā)現(xiàn)，添加白地霉的脫毒方式脫毒效果較NaHSO3溶液浸泡好，而NaHSO3溶液浸泡方式所制得的麥芽、麥汁和啤酒的指標(biāo)較好。兩種脫毒方式所得麥芽的理化指標(biāo)均符合QB/T1686-2008中啤酒麥芽的要求，所制得成品啤酒的常規(guī)理化指標(biāo)均符合GB 4927-2008中淡色啤酒的理化要求。采用添加白地霉的脫毒方式可以制備滿足啤酒釀造要求的麥芽，同時(shí)可以避免化學(xué)試劑的殘留等潛在影響。通過研究白地霉制麥的機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化制麥工藝，獲得更高品質(zhì)的麥芽將不再遙遠(yuǎn)。

［1］Salas B，Steffenson B J，et al.Fusarium species pathogenic to barley and their associated mycotoxins［J］.Plant Dis，1999，83 (7):667-674.

［2］Prom L K，Horsley R D，et al.Development of Fusarium head blight and accumulation of deoxynivanol in barley sampled at different growth stages［J］.J Am Soc Brew Chem，1999，57(2): 60-63.

［3］Desjardins A E.Fusarium mycotoxins［M］.The American Phytopathological Society，2006:13-19.

［4］陸健，趙海峰.啤酒及其生產(chǎn)原料中的真菌毒素［J］.食品工業(yè)科技，2006，27(7):185-189.

［5］Schwarz P B，Horsley R D，et al.Quality risks associated with the utilization of Fusarium head blight infected malting barley［J］.J Am Soc Brew Chem，2006，64(1):1-7.

［6］Steffenson，B J.Fusarium head blight of barley:research update［Z］.Proceedings，Red River Barley Day.American Malting Barley Association，Milwaukee，WI，1996.

［7］Wolf-Hall C E.Mold and mycotoxin problems encountered during malting and brewing［J］.Int J Food Microbiol，2007，119 (1-2):89-94.

［8］Faifer G C，Velazco V，Godoy，H M.Adjustment of the conditions required for complete decontamination of T-2 toxin residues with alkaline sodium hypochlorite［J］.Environ Contam Toxicol，1994，52:102-108.

［9］ Young J C，Blackwell B A，ApSimon J W.Alkaline degradation of the mycotoxin 4-deoxynivalenol［J］.Tetrahedron Lett，1986，27:1019-1022.

［10］ YoungJC，Trenholm H L，etal.Detoxificationof deoxynivalenol with sodium bisulphate and evaluation of the effects when pure mycotoxin or contaminated corn was treated and given to pigs［J］.J Agric Food Chem，1987，35:259-261.

［11］Boivin P，Malanda，M.Improvement of malt quality and safety by adding starter culture during the malting process［J］. MBAA Tech Q，1997，34:96-101.

［12］Lowe D P，Arendt E K.The use and effects of lactic acid bacteria on malting and brewing with their relationships to antifungal activity，mycotoxins and gushing:a review［J］.J Inst Brew，2004，110:163-180.

［13］Vaughan A，O'Sullivan T，van Sinderen D.Enhancing the microbiological stability of malt and beer-a review［J］.J Inst Brew，2005，111:355-371.

［14］金昭，陸健，蔡國林，孫軍勇.HPLC法測(cè)定啤酒原料中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素［J］.啤酒科技，2009(3):44-47.

［15］QB/T 1686-2008.中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn):啤酒麥芽［S］.

［16］GB/T 4928-2008.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn):啤酒分析方法［S］

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Study on the control approaches of deoxynivalenol during beer production

CAI Guo-lin1，2，JIN Zhao2，LU Jian1，2，*
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China; 2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The controlapproaches ofdeoxynivalenolduring beerproduction were studied.Two typical representatives of the chemical detoxification method and the microbiological detoxification method，respectively，NaHSO3solution soaking barley before malting and malting with G.candidum，were studied.The results showed that the detoxification effect of latter method was better，and the qualities of malt and beer in the former one were better.However，the qualities of malt and beer produced by above methods could meet the requirements of QB/T 1686-2008 and GB 4927-2008，respectively.

deoxynivalenol;mycotoxin;beer;control

TS262.5

A

1002-0306(2011)07-0203-04

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，又稱嘔吐毒素，是鐮孢霉屬真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物［1］。DON是毒性較弱的真菌毒素之一，但由于在自然界中廣泛存在，已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織確定為最危險(xiǎn)的自然發(fā)生食品污染物之一。麥芽是大麥在特定的溫度和濕度下發(fā)芽而制成的，是釀造啤酒的主要原料。DON作為大麥的天然污染物，在大麥的田間生長(zhǎng)和儲(chǔ)藏過程中都可能產(chǎn)生，并存留在大麥中，在制麥和釀造過程中，殘留或重新形成的DON有可能被帶進(jìn)啤酒中［2-4］。在啤酒生產(chǎn)領(lǐng)域，由鐮孢霉屬真菌感染引起的相關(guān)食品安全問題，當(dāng)前最有效的控制方法就是避免使用此類啤酒大麥。然而，在鐮孢霉屬真菌感染大麥比較泛濫的年代，這種控制手段將使啤酒大麥的供應(yīng)趨于緊張;同時(shí)，徹底棄用這類大麥也將會(huì)給大麥種植區(qū)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［5］。選育抗鐮孢霉屬真菌感染的大麥目前正在研究中，但即使抗鐮孢霉屬真菌感染的大麥品種能夠?qū)崿F(xiàn)，新品種仍需具備符合制麥要求質(zhì)量的特性，所以，至今仍沒有真正的抗鐮孢霉屬真菌感染的大麥品種面市。因此，通過一些技術(shù)手段使一定比例的鐮孢霉屬真菌感染的大麥得到應(yīng)用是非常重要的。目前經(jīng)濟(jì)、有效地去除大麥DON的物理或化學(xué)方法還很少。由于大麥顆粒大小和DON含量的關(guān)系不呈正相關(guān)，所以適用于小麥、玉米等谷物的剔除干癟顆粒法是不可靠的，同時(shí)由于大麥外殼與內(nèi)核之間的霉菌和DON含量較高，簡(jiǎn)單的清洗也不能有效地降低成品麥芽的DON含量［6-7］;采用化學(xué)試劑可以降解DON或與DON形成無毒結(jié)合物，如氨水、臭氧、雙氧水和NaHSO3等［8-10］，但是，很多釀酒師不能接受這些方法，他們認(rèn)為這些方法對(duì)大麥的質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，也不愿意啤酒中殘留有化學(xué)品或潛在的有害物質(zhì)。最新的研究認(rèn)為，DON最佳的脫毒方法是通過篩選有益的微生物，通過競(jìng)爭(zhēng)的機(jī)制抑制鐮孢霉屬真菌的生長(zhǎng)、代謝，從而達(dá)到DON脫毒的目的［11-12］，但它對(duì)麥芽質(zhì)量的影響仍需進(jìn)一步的研究。本研究采用NaHSO3溶液浸泡和在浸麥過程中添加白地霉處理鐮孢霉屬真菌感染的國產(chǎn)啤酒大麥，研究?jī)煞N不同方法對(duì)DON在制麥和釀造過程中變化情況的影響，并綜合評(píng)價(jià)兩種脫毒方式對(duì)麥芽和啤酒品質(zhì)的影響，初步探索啤酒生產(chǎn)過程中有效的DON脫毒方式。

2010-05-31 *通訊聯(lián)系人

蔡國林(1981-)，男，工程師，研究方向:釀酒科學(xué)與工程。

國家“十一五”支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAK36B01);國家“十一五”支撐重點(diǎn)項(xiàng)目資助(2008BAI63B06);江南大學(xué)青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2008LQN016);江蘇省“青藍(lán)工程”資助項(xiàng)目。