韓冬梅，廖小軍，李淑燕，胡小松，吳繼紅

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點開放實驗室，果蔬加工教育部工程研究中心，北京100083）

酶法制取橙皮果膠的研究

韓冬梅，廖小軍，李淑燕，胡小松，吳繼紅*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點開放實驗室，果蔬加工教育部工程研究中心，北京100083）

纖維素酶酶系組成復(fù)雜，不同來源纖維素酶在果膠提取中表現(xiàn)出的作用不同。采取與前人研究不同的纖維素酶對橙皮果膠進(jìn)行提取，對三種不同來源的纖維素酶比較分析，篩選出一種價格低廉、適合果膠提取的纖維素酶，并采用四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法研究了其提取果膠工藝中緩沖溶液的pH、提取時間、酶添加量、提取溫度對果膠得率的影響；建立數(shù)學(xué)模型，尋求測定條件的最優(yōu)組合；以Design Expert軟件進(jìn)行分析，模型經(jīng)檢驗差異顯著，失擬檢驗不顯著，具有良好的統(tǒng)計學(xué)意義，最優(yōu)組合為：酶添加量3.38mL、時間6.66h、溫度47.5℃、pH4.95，預(yù)測模型果膠得率為14.43%，驗證實驗得率為14.79%，大大提高了纖維素酶制取果膠的得率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報道，并且酶的價格低廉，大大降低了生產(chǎn)成本。

橙皮，果膠，纖維素酶，二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

贛南臍橙 新鮮采摘，果皮部分未經(jīng)打蠟，90℃水浴滅酶5min，40℃真空干燥至含水量11.49%。粉碎過60目篩，真空包裝后冷藏備用；纖維素酶Sigma公司、日本Fluka公司、上海凱樣生物科技有限公司。

飛鴿牌TDL-5型低速離心機 廣州正一科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；ZF-400真空包裝機 北京瑞明包裝機械科技有限公司；紫外分光光度計 北京普析通用有限責(zé)任公司；水浴搖床 太倉市實驗設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶液的配制 精確稱取纖維素酶0.3000g，用配好的的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液定容到100mL容量瓶中，醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的pH根據(jù)提取的實驗設(shè)計變化，根據(jù)實驗要求當(dāng)天配制。

1.2.2 酶活的測定 纖維素酶活根據(jù) Ghose［9］和Miller［10］的方法測定。濾紙酶活單位定義為：1min生成1!moL葡萄糖所需要的酶量。果膠酶活力的測定根據(jù)Beg的方法測定［11-12］。果膠酶活定義：1g酶粉或1mL酶液在50℃、pH3.5的條件下，1h分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活單位。

1.2.3 工藝流程 贛南橙橙皮粉（60目）→水浴搖床酶提取→離心→上清液→85℃滅酶→2倍體積乙醇沉淀過夜→離心→沉淀→乙醇清洗→真空干燥

1.2.4 操作要點 稱取6.000g橙皮粉，加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，料液比1∶15；加入一定的酶液，放入水浴搖床中提取，提取液5000r/min，離心10min，用50mL蒸餾水清洗殘渣，離心，合并上清液。上清液85℃水浴滅酶5min，冷卻，2倍體積乙醇沉淀過夜，5000r/min，離心5min，分離沉淀出的果膠，用400目濾布15mL乙醇清洗兩次，每次5min以除去色素和游離的中性糖，最后40℃真空干燥3h，稱量（精確到0.0000），終產(chǎn)品含水量為11.6%。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的篩選

果膠的提取條件為：45℃，6h，pH4.8，酶添加量2mL，料液比1∶15。

纖維素酶系中包括內(nèi)切酶（EG1、EG2），外切酶（CBH1、CBH2），"-葡聚糖酶。不同來源的纖維素酶系其內(nèi)部各酶比例不同，因而可能導(dǎo)致整體表觀作用不同，同時"-葡聚糖酶對果膠也具有一定的破壞作用，導(dǎo)致了纖維素酶在橙皮果膠提取中表現(xiàn)出雙重作用。由于純酶的成本高，在果膠提取中難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，因此只能尋找合適組成比例的酶作為果膠提取用酶。

由圖1可見，Sigma公司C0615纖維素酶濾紙酶活最高，果膠酶活未檢出，但當(dāng)作用于果膠提取時，原料中果膠被分解。Zykwinska A在研究中測定了諾維信產(chǎn)纖維素酶中鼠李糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶等多種能夠分解果膠側(cè)鏈的酶，發(fā)現(xiàn)這些酶存在一定的活性，因此可能是這些酶的存在以及纖維素酶系中的"-葡聚糖酶的存在導(dǎo)致實驗中果膠分解。實驗中高劑量和低劑量酶添加量在不同提取時間的組合實驗中，作用于原料后都只能得到澄清的均一溶液，因此斷定此酶不適合果膠的提取，僅適合于果汁澄清。日本Fluka公司產(chǎn)纖維素酶R-10也存在同樣問題。上海凱洋公司產(chǎn)纖維素酶的果膠酶活未檢出，濾紙酶活力雖然最低，但將其作用于果膠提取，得率最高，因而可以將此酶用于果膠的酶法提取研究。

圖1 不同產(chǎn)品纖維素酶酶活及對果膠提取的影響

2.2 酶添加量對橙皮果膠提取的影響

固體酶活力單位是121U/g，以緩沖溶液將固體酶配制成濃度為0.0030g/mL的酶液。

由圖2可知，當(dāng)酶使用量在低于0.5mL/g皮渣時，果膠提取率隨加酶量的增加而增高，且增加幅度比較大，當(dāng)使用量大于0.5mL/g皮渣時，隨著酶使用量的增加，果膠得率又減小。經(jīng)分析，由于實驗所用纖維素酶并非純酶，復(fù)合酶系中可能存在"-葡聚糖酶及其它能夠水解果膠的阿拉伯糖苷酶、鼠李糖苷酶、半乳糖苷酶，果膠分子鏈水解，生成的低分子量果膠增加，在含有過濾清洗的工藝下這部分果膠損失。

圖2 酶添加量對果膠得率的影響

2.3 提取時間對橙皮果膠提取的影響

由于提取用纖維素酶對果膠有一定的水解作用，且由于提取溫度比較溫和，隨著提取時間的延長，提取液容易染菌，Shkodina［6］、邸錚［13］等在提取液中加入0.01%疊氮化鈉作抑菌劑，疊氮化鈉本身為呼吸抑制劑，劇毒，在實際生產(chǎn)中是不能使用的。因此控制提取時間在6～8h內(nèi)以獲取最大提取量，避免果膠被大范圍水解。

圖3 提取時間對果膠得率的影響

2.4 提取溫度對橙皮果膠提取的影響

溫度對果膠的提取影響比較大，有兩個原因：一是高溫能增加果膠溶出的傳質(zhì)動力，二是酶具有最適作用溫度。當(dāng)溫度低于45℃時，隨溫度提高果膠得率增加速度很快，當(dāng)溫度高于45℃后，果膠得率又出現(xiàn)下降的趨勢，傳統(tǒng)的提取方法中以高溫高酸提取果膠，因此在一定范圍內(nèi)提高溫度對果膠得率影響是促進(jìn)作用，所以當(dāng)溫度升高時，雖然同樣是遠(yuǎn)離酶的最適溫度，峰值左側(cè)和右側(cè)的變化速度不同。

圖4 提取溫度對橙皮果膠提取的影響

2.5 緩沖溶液pH對橙皮果膠提取的影響

圖5顯示pH在4.8附近，果膠提取率最高，在此處酶的活性最大，當(dāng)pH增大或減小時，酶遠(yuǎn)離了最適pH，活性下降，但是當(dāng)pH為4時，盡管其并非酶作用的最適pH，但結(jié)果顯示果膠的提取率并沒有隨pH下降而降低，這是因為此時酸的作用占優(yōu)勢，因此是協(xié)同作用的結(jié)果。

圖5 提取pH對橙皮果膠提取的影響

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化

以酶添加量、提取時間、提取溫度、提取pH四個因素，采用二次通用旋轉(zhuǎn)實驗進(jìn)行設(shè)計，第一：滿足其旋轉(zhuǎn)性，即實驗因素空間中與實驗中心距離相等的球面上各處理組合的預(yù)測值的方差具有幾乎相等的特性；第二：除了能滿足其旋轉(zhuǎn)性，能滿足其通用性，即各個實驗點與中心的距離ρ在空間編碼值區(qū)間0＜ρ＜1的范圍內(nèi)，其預(yù)測值的方差基本相等的性質(zhì)。實驗設(shè)計中包括中心點7個，軸點8個，析因點16個，總處理數(shù)N=31［14］。因素水平分布及實驗結(jié)果見表1及表2。

表1 四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計因素水平分布

以Design Experts軟件的CCD模塊對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，方差分析結(jié)果如表3。

表2 二次通用旋轉(zhuǎn)實驗設(shè)計矩陣及實驗結(jié)果

表3 方差分析表

方差分析表明方程的模型回歸檢驗F=24.50，差異在0.01水平上極顯著。失擬檢驗F=2.30，差異不顯著，模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。編碼因素A、B、C、D、AB、BD、A2、B2、C2、D2差異顯著，其他項差異不顯著，剔除不顯著項，回歸模型的編碼方程為：

（R2=0.9607，調(diào)整后 R2=0.9213，預(yù)測 R2= 0.7238）

優(yōu)化后的工藝參數(shù)為：酶添加量0.56mL/g干皮渣（取活性為121U/g的固體酶0.3000g用緩沖溶液定容到100mL，）、提取時間6.66h、提取溫度47.51℃、提取 pH4.95，此工藝基礎(chǔ)上，預(yù)測果膠得率為14.43%，驗證實驗（實際提取溫度為47.5℃）果膠得率為14.79%。

3 結(jié)論

本實驗首先測定了三種不同來源的纖維素酶的濾紙酶活，果膠酶活，以及在不同的使用量下果膠的得率，據(jù)此選取上海凱洋公司的纖維素酶作為實驗用酶。

通過單因素水平實驗，確定了酶提工藝中各個單因素的最優(yōu)范圍：溫度40～50℃，提取時間6～8h，酶用量0.33～0.67mL/g干皮渣，pH4.4～5.2之間。

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，運用二次通用旋轉(zhuǎn)實驗設(shè)計，并以Design Experts軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定了酶提工藝的數(shù)學(xué)模型及最優(yōu)工藝參數(shù)，在提取溫度47.5℃，提取時間6.66h，酶用量0.56mL/g干皮渣，pH4.95下，橙皮果膠的得率達(dá)到了14.79%，與預(yù)測值14.43%基本一致，說明模型是可靠的。

本實驗選用的纖維素酶與先前研究中的所用酶相比價格低廉，大大降低了酶法提取果膠的成本。將本實驗所得酶法提取工藝參數(shù)用于橙皮果膠提取中，果膠的得率為14.79%，高于同類研究中2008年Zykwinska使用的諾維信產(chǎn)纖維素酶提柑橘果膠得率12.6%，高于2009年蘇艷玲［15］研究中的選用的纖維素酶提取柑橘果膠得率的6.109%，因此不同的來源的纖維素酶在提取果膠時具有差異，實際工業(yè)生產(chǎn)中選用不同的纖維素酶時需分別進(jìn)行研究。此外酶法提取果膠工藝是在溫和的條件下操作，比傳統(tǒng)高酸、高溫提取工藝安全，且所得果膠色淺，適用的范圍將會更廣，干燥后容易粉碎。近幾年的研究報道也發(fā)現(xiàn)酶法提取的果膠在成分組成、酯化度、半乳糖醛酸含量方面不同于傳統(tǒng)工藝提取果膠，本實驗采用此纖維素酶所得果膠的品質(zhì)也有待于進(jìn)一步的研究。

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Cellulase extraction of pectin from orange peel

HAN Dong-mei，LIAO Xiao-jun，LI Shu-yan，HU Xiao-song，WU Ji-hong*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Engineering Research Centre for Fruits and Vegetables Processing，Ministry of Education，Key Laboratory of Fruits and Vegetables Processing，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China）

The characteristics of cellulase system is complicated，cellulase from different sources act with different effects in pectin extraction.The extraction of pectin from orange peel by cellulases which was different from the ones in literatures was studied.One kind of low-cost cellulase suitable for pectin extraction was screened out from three kinds of cellulases.And the effects of extraction pH，temperature，time，enzyme concentration on the pectin yield were studied by quadratic regression rotational composite design.The best effective factors were determined.Via statistical software of Design Expert analysising，the model was significant and the lack of fit was not significant with obvious statistical significance.The optimal combination forecasting model was drew on volume of enzyme 3.38mL，time 6.66h，temperature 47.5℃，pH4.95，pectin yield of forecasting model was 14.43%and verification experiment was 14.79%.Pectin yield was improved greatly and much higher than the reported in literatures，and cellulose was low-cost，so cost of production can be saved greatly.

orange peel；pectin；cellulose；quadratic regression rotational composite design

TS201.7

B

1002-0306（2011）02-0183-04

果膠作為一種食品添加劑，以其良好的膠凝性、穩(wěn)定性、增稠性、優(yōu)良的口感、低糖和低熱量等性能受到人們的青睞。FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合委員會推薦果膠為不受添加量限制的安全食品添加劑。酶法提取柑橘皮中的果膠是繼傳統(tǒng)酸法［1-2］、微波方法［3-5］之后的另一種新穎的提取方法，具有提取條件溫和，操作安全，不污染環(huán)境等優(yōu)點，被譽為“綠色生產(chǎn)”。酶法提取果膠用酶根據(jù)橘皮材料的構(gòu)成，較多采用纖維素酶進(jìn)行研究，由于不同菌種、培養(yǎng)條件的差異，導(dǎo)致纖維素酶系的構(gòu)成比例不同［8］，導(dǎo)致不同的纖維素酶對皮渣的綜合作用不同，并且國內(nèi)外在酶法提取果膠的研究中，普遍存在提取用酶的成本高［6-8］，難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的問題，本文通過酶的篩選，選取了一種價格低廉、適合果膠提取的纖維素酶進(jìn)行研究，以期為酶法提取果膠技術(shù)的進(jìn)一步研究提供參考。

2010-02-25 *通訊聯(lián)系人

韓冬梅（1983-），女，在讀碩士研究生，研究方向：果蔬加工。

國家863計劃（2007AA10Z307）。