張 蓮，王金鵬，孔子青，陳曉明，徐學(xué)明，金征宇

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122)

硫酸軟骨素的降解及其降解產(chǎn)物抗氧化活性的測定

張 蓮，王金鵬，孔子青*，陳曉明，徐學(xué)明，金征宇*

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122)

對高分子硫酸軟骨素分別進行酸解及酶解，得到相同分子質(zhì)量范圍的硫酸軟骨素低聚糖。從聚丙烯酰胺凝膠電泳、分子質(zhì)量、紫外吸收圖譜、硫酸基含量等方面對降解產(chǎn)物進行了表征，并檢測了產(chǎn)物的DPPH自由基的清除能力及還原能力。結(jié)果表明，在控制條件下兩種降解方法得到的硫酸軟骨素低聚糖的重均分子量為5300～3500u，且組分基本相同;紫外分析表明，酸解得到的硫酸軟骨素低聚糖含有不飽和糖醛酸，具有部分雙鍵;與酶解產(chǎn)物相比，酸解產(chǎn)物的DPPH自由基的清除能力及還原能力較強。

硫酸軟骨素寡糖，降解，抗氧化活性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硫酸軟骨素 食品級，陜西森弗生物科技有限公司;透明質(zhì)酸酶 HAase，牛睪丸，EC 3.2.1.35; sigma公司，Type I－S，437U/mg;其余試劑 均為分析純。

Waters 600高效液相色譜儀 配2410示差折光檢測器和Empower工作站;V－1800可見分光光度計 上海光譜達儀器有限公司;DKZ恒溫振蕩水浴槽 上海一恒科技有限公司;BIO－RAD powerpac電泳儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶法降解制備硫酸軟骨素寡糖 將0.2g硫酸軟骨素溶解于10mL pH5.9的磷酸鹽緩沖液中，置于37℃保溫10min，使其與反應(yīng)溫度達到一致，爾后向底物溶液中加入一定量的HAase，使其酶活為1.4× 105u/L，振蕩反應(yīng)22h。反應(yīng)結(jié)束后，加熱煮沸20min使酶失活，4000r/min離心15min，取上清液加3倍體積95%乙醇沉淀，靜置，乙醇脫水3次，真空干燥得硫酸軟骨素低聚糖A。

1.2.2 酸法降解制備硫酸軟骨素寡糖 將0.35g硫酸軟骨素溶解于10mL 0.4mol/L鹽酸溶液中，置于65℃恒溫振蕩水浴鍋中，控制反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用0.4mol/L NaOH溶液中和至中性。3倍體積95%乙醇沉淀，靜置，乙醇脫水3次，真空干燥得硫酸軟骨素低聚糖B。

1.2.3 分子質(zhì)量的測定 采用高效凝膠過濾色譜(HPGFC)法測定。色譜柱:UltrahydrogelTMLinear 300mm×7.8mmid×2;流動相:0.1mol/L NaNO3;流速:0.9mL/min;柱溫:45℃;檢測器:2410示差折光檢測器。

1.2.4 天然PAGE分析 電泳條件:濃縮膠濃度5%，分離膠濃度35%;室溫，200V，1.5h。染色條件: 0.5%甲苯胺藍溶于2%乙酸溶液中，染色1h。脫色: 2%乙酸脫色。

1.2.5 紫外吸收分析 將硫酸軟骨素低聚糖A、B用去離子水充分溶解，室溫下，用紫外可見分光光度計在190～400nm范圍內(nèi)進行掃描，以去離子水作為空白進行基線調(diào)零。

1.2.6 硫酸基含量的測定 硫酸基含量采用硫酸鋇比濁法測定［11］。

稱取硫酸軟骨素低聚糖 A、B各50mg，置于25mL容量瓶中，加入 1mol/L HCl溶液 5mL，于100℃水浴中水解2h，冷卻后，加鹽酸溶液補至刻度線，濾紙過濾，除去不溶物質(zhì)。

分別吸取樣品液0.2mL，加入三氯乙酸溶液3.8mL及氯化鋇溶液 1.0mL，搖勻，室溫下靜置15min，360nm測吸收度A1;以1.0mL明膠溶液代替氯化鋇溶液，測吸收度A2。以0.2mL 1mol/L HCl溶液作空白。

1.2.7 抗氧化能力的測定

1.2.7.1 對DPPH·的清除 DPPH·清除能力根據(jù)文獻［12］測定并稍做改進。200μL 40 mg/mL的硫酸軟骨素低聚糖 A、B溶液，加入 800μL 0.004% (w/v)DPPH·無水乙醇溶液。室溫振蕩30min，517nm處測定吸光度。以抗壞血酸作對照。

式中:AC:除樣品外包含所有試劑的吸光度;AS:樣品吸光度。

1.2.7.2 還原能力的測定 還原能力根據(jù)文獻［12］測定。向1mL 40mg/mL的硫酸軟骨素低聚糖A、B溶液加入2.5mL 200mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.6)及2.5mL 1%的硫氰化鉀溶液。50℃振蕩20min后加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液。5000r/min離心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL去離子水及0.5mL 0.1%氯化鐵溶液，700 nm測吸光度。以抗壞血酸作對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 硫酸軟骨素的降解

美國專利局USP 3，405，120已證明，分子質(zhì)量在5300～3500u時，硫酸軟骨素的藥理活性最強，對防治動脈粥樣硬化、風(fēng)濕性炎癥和傷口愈合等具有更好的療效［9］，故本實驗降解目標(biāo)分子質(zhì)量范圍為5300～3500u。PAGE分析表明，在酶解和酸解作用下，高分子CS已發(fā)生降解，且兩種方法所得降解產(chǎn)物的組分基本相同(見圖1)。經(jīng)HPGFC測定，CS原料的重均分子質(zhì)量(Mw)為65142u，經(jīng)酸降解后為5020u，經(jīng)酶降解后為4796u(見表1)。與CS相比，降解后的CS寡糖分子質(zhì)量分散指數(shù)(Mw/Mn)有所降低，并且酶解得到的產(chǎn)物分子質(zhì)量分散指數(shù)比酸解產(chǎn)物更低，表明酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布范圍較窄。此外，酶解后低分子質(zhì)量硫酸軟骨素顏色為乳白色，與高分子質(zhì)量硫酸軟骨素原料顏色相近，而酸解后顏色為橘紅色，這種顏色的變化可能會限制酸解低分子質(zhì)量硫酸軟骨素在美容或某些特定食品中的應(yīng)用。

圖1 硫酸軟骨素及其降解產(chǎn)物的PAGE分析

表1 硫酸軟骨素及其降解產(chǎn)物的分子質(zhì)量特征

2.2 紫外吸收光譜分析

硫酸軟骨素低聚糖 A、B的紫外吸收圖譜見圖2。由圖2中可以看出，兩個吸收圖譜的形狀較為接近，在210nm左右均具有很強吸收峰。分析表明，210nm為羰基的特征吸收峰;280nm左右吸收峰很小，說明幾乎不含蛋白質(zhì)、核酸等成分;CS低聚糖A在235nm處無明顯特征吸收峰，說明用牛睪丸透明質(zhì)酸酶降解CS所得產(chǎn)物為飽和寡糖，這與Kennita L.Jobe［6］的報道相吻合;CS低聚糖B在230～240nm處吸收峰變寬，這可能是由于生成了4，5－不飽和糖醛酸等不飽和結(jié)構(gòu)［13－14］。

表2 硫酸軟骨素及其降解產(chǎn)物硫酸基含量及抗氧化活性

圖2 低分子質(zhì)量硫酸軟骨素UV圖譜

2.3 抗氧化能力的測定

2.3.1 對DPPH·的清除作用 表2顯示了降解產(chǎn)物對DPPH·的清除作用。從表2可以看出，酸解產(chǎn)物對DPPH·的清除作用高于酶解產(chǎn)物。硫酸軟骨素作為糖胺聚糖的一種，其結(jié)構(gòu)中硫酸基的數(shù)量和連接位置使其表現(xiàn)出不同的生物活性［2］，不飽和結(jié)構(gòu)的有無也使其具有不同的抗炎活性［6］，這可能也是其抗氧化活性的重要因素。目前，尚未有人對硫酸軟骨素低聚糖的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)及硫酸基含量之間的關(guān)系做過研究報道。通過對兩種降解產(chǎn)物硫酸基含量的測定可知，酶解和酸解后CS低聚糖A、B硫酸基含量分別為11.83%和8.98%，與高分子硫酸軟骨素相比硫酸基含量有所降低(12.95%)，酸解造成了硫酸基更多的脫除，具體結(jié)果見表2。我們認(rèn)為，一方面，硫酸基含量的降低可能會造成對DPPH·清除能力的下降，這在酸解所得卡拉膠低聚糖的抗氧化活性中亦得到了體現(xiàn)［10］。另一方面，酸解過程中雙鍵的形成可能提高了CS低聚糖B對DPPH·的清除能力。Jamal Alyoussef Alkrad［15］等人也曾報道，透明質(zhì)酸糖胺聚糖在降解過程中形成的雙鍵對自由基毒性的降低起到了至關(guān)重要的作用。具有較低硫酸基含量的CS低聚糖B，其DPPH·清除能力較強，推測CS低聚糖B中的不飽和雙鍵對DPPH·清除能力至關(guān)重要，硫酸基含量和DPPH·清除能力之間并無顯著聯(lián)系。

2.3.2 還原能力的測定 還原能力主要與氫離子的供應(yīng)有關(guān)。物質(zhì)的還原能力是揭示其抗氧化活性的一個重要的指標(biāo)?；衔锏目寡趸钚耘c許多機制有關(guān)，例如阻止反應(yīng)鏈的引發(fā)，阻止過渡金屬離子的催化，過氧化氫的分解等。硫酸軟骨素的還原能力機制可能與其結(jié)構(gòu)中羰基的存在有關(guān)［16］，其上帶電基團可能也與過渡金屬離子如Cu2+或Fe2+等發(fā)生作用。酸解CS低聚糖B較酶解CS低聚糖A具有更高的還原能力，這可能同樣是與酸解過程中雙鍵的形成有關(guān)(見圖3)。

3 結(jié)論

采用酸解和酶解兩種方法制備了相同分子質(zhì)量范圍的硫酸軟骨素低聚糖，所得降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同，造成了其抗氧化能力的不同。酸解得到的硫酸軟骨素低聚糖具有更好的DPPH·清除能力以及還原能力，這可能與酸解過程中雙鍵的形成有關(guān)，推測硫酸軟骨素寡糖中不飽和糖醛酸結(jié)構(gòu)的生成對DPPH·清除能力以及還原能力的提高起到了至關(guān)重要的作用，而硫酸基的含量對其無明顯影響。

圖3 硫酸軟骨素低聚糖的還原能力

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Degradation of chondroitin sulfate and antioxidation of its degraded products

ZHANG Lian，WANG Jin－peng，KONG Zi－qing*，CHEN Xiao－ming，XU Xue－ming，JIN Zheng－yu*
(State Key Laboratory of Food Science＆Technology，School of Food Science and Technology，Southern Yangtze University，Wuxi 214122，China)

Two chondroitin sulfates oligosaccharides in the same weight were prepared by HAase degradation and acid degradation.The structures were characterized by PAGE，molecular weight，UV and sulfate content，and the scavenging effects on 1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl and reducing powers of chondroitin sulfate oligosaccharides were investigated.Under controlled conditions，the chondroitin sulfate oligosaccharides had same compositions，and their number average molecular weights were about 5300～3500u.Some double bonds were produced in the chondroitin sulfate oligosaccharides of acid degradation from the UV absorption spectra，and the antioxidant activity and DPPH radicals were higher than the oligosaccharides by HAase degradation.

chondroitin sulfate oligosaccharides;degradation;antioxidant activity

TS201.2+3

A

1002－0306(2011)12－0180－04

硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate，CS)由D－葡糖醛酸與N－乙酰－D－氨基半乳糖酸硫酸酯組成，是一類廣泛存在于人類和動物的喉骨、鼻中隔、氣管等軟骨組織中的酸性黏多糖［1］，屬于糖胺聚糖的一種。高分子質(zhì)量的CS具有較高的生物活性，在細(xì)胞轉(zhuǎn)移、分化、增殖、識別以及組織形成等生物過程中起到了重要的作用［2］，目前在醫(yī)藥及臨床中已有所應(yīng)用［1］。但是由于細(xì)胞膜的選擇透過性等因素，臨床應(yīng)用中大部分糖胺聚糖主要面臨生物利用率較低的問題［3］。最近幾年，低分子質(zhì)量CS的功能特性越來越受到人們的重視［4－6］，但國內(nèi)對CS的研究主要集中于其提取、生理活性及衍生物等方面，對CS寡糖的研究未見報道。目前，CS低聚糖主要由酶［4］和酸［7－9］等降解而得。酶解法因條件溫和、專一性強，是目前最常用的降解硫酸軟骨素的方法，但是不同來源的酶對硫酸軟骨素的酶解機理不同，導(dǎo)致所得到的CS寡糖的結(jié)構(gòu)及功能略有不同，例如由哺乳動物酶產(chǎn)生的CS低聚糖為飽和寡糖，可能具有促炎作用，而由細(xì)菌酶產(chǎn)生的低聚糖含有不飽和糖醛酸，具有部分雙鍵，可能沒有促炎作用或具有抗炎作用［6］。酸降解相對劇烈，可能會引起部分硫酸基的水解，導(dǎo)致體外自由基清除能力的降低［10］。本文采用了酶解和酸解兩種手段對硫酸軟骨素進行了降解，對兩種方法降解得到的硫酸軟骨素低聚糖的特性進行了比較，并研究了其抗氧化活性，以期為硫酸軟骨素降解方法的選擇提供一定的依據(jù)，并為硫酸軟骨素寡糖的制備及其抗氧化活性的研究提供一定參考。

2010－12－20 *通訊聯(lián)系人

張蓮(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:碳水化合物資源。

國家自然科學(xué)基金(20976070)。