劉 艷，薛正蓮，胡劉秀，劉杉林，金 花

(1.安徽工程大學生物與化學工程學院，微生物發(fā)酵安徽省工程技術研究中心，安徽蕪湖 241000;

2.蕪湖張恒春藥業(yè)有限公司，安徽蕪湖 241009)

硅膠柱分離純化發(fā)酵液中葉酸的工藝研究

劉 艷1，薛正蓮1，胡劉秀2，劉杉林1，金 花2

(1.安徽工程大學生物與化學工程學院，微生物發(fā)酵安徽省工程技術研究中心，安徽蕪湖 241000;

2.蕪湖張恒春藥業(yè)有限公司，安徽蕪湖 241009)

采用硅膠柱層析法分離純化產朊假絲酵母Y2.12發(fā)酵液，在考察洗脫劑種類、洗脫劑配比、上樣液流速以及上樣量這些單因素對葉酸分離效果的影響的基礎上，通過響應面分析找出最優(yōu)工藝參數。結果表明:產朊假絲酵母Y2.12發(fā)酵液分離純化得到葉酸的最佳工藝條件為:上樣液流速為1.26mL/min，發(fā)酵液上樣量為5.29mL，洗脫劑乙醇與氨水之比1.84∶1，所提取的葉酸質量為(101.12±0.13)μg。

硅膠柱，葉酸，分離，產朊假絲酵母，響應面分析

葉酸(Folic acid)屬于B族維生素，對細胞分裂和生長具有十分重要的作用［1－4］。人體缺乏葉酸會引發(fā)嬰兒的核巨紅細胞性貧血、孕婦的巨紅細胞性貧血、新生兒的神經系統異常和老年癡呆癥等疾?。?－8］，因此葉酸具有十分重要的藥用價值和開發(fā)前景。由于目前工業(yè)化生產葉酸主要采用化學合成法，這種方法存在種種弊端，而發(fā)酵法生物合成葉酸存在著明顯的優(yōu)勢，所以生物法合成葉酸具有十分重要的應用前景。本研究中心經紫外激光誘變，已篩選出一株產葉酸量高的菌種產朊假絲酵母Y2.12［9］，并對該菌種的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，對高效地分離其有效成分具有十分重要的意義。硅膠其表面含有硅羥基，與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵從而具有吸附性能。從葉酸的分子結構來看，葉酸為不飽和分子，硅膠對它的吸附力不是特別強，因此，葉酸吸附在柱上易被洗脫。另外，硅膠是略帶酸性的物質，適用于酸性和中性物質的分離，葉酸也帶酸性，因此硅膠柱層析法可以很好地用于葉酸的分離純化。SAS(statistical analysis system)統計軟件，能用少量的實驗次數和時間對實驗進行全面的研究，取得明顯有效的結論，避免了有交互作用的多因子實驗可能造成的不可靠結論［10－13］。本實驗借助響應面法對選育獲得到的產朊假絲酵母Y2.12的發(fā)酵液進行分離純化條件優(yōu)化，旨在為生物法合成葉酸的工業(yè)化生產奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯仿，濃鹽酸，葉酸純品 均為分析純;截留分

子量14000的透析袋 北京經科宏達生物技術有限公司;100－200目柱層析硅膠 國藥集團化學試劑有限公司;層析柱規(guī)格(內徑×長度) 1.6cm×50cm。HD－21－88核酸蛋白檢測儀、BSZ－100－LCD 自動部分收集器、BT1－100恒流泵 上海琪特分析儀器有限公司;UV－2550紫外可見分光光度計 日本島津;SW－CJ－CO型雙人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;BS－IE型振蕩培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 經激光和紫外復合誘變過的產朊假絲酵母Y2.12→菌種活化4d→搖瓶種子培養(yǎng)1d→發(fā)酵擴大培養(yǎng)2d即得

1.2.2 發(fā)酵液預處理 將發(fā)酵液倒入透析袋中，每隔6h換蒸餾水一次，透析48h。

1.2.3 發(fā)酵液的分離純化

1.2.3.1 硅膠層析柱的填充 將硅膠于濃鹽酸中浸泡24h后，不斷加蒸餾水沖洗直至檢驗無氯離子為止，然后在110℃烘箱中活化2h?；罨蟮墓枘z加氯仿浸泡并攪拌均勻，然后傾入層析柱中，并于上端鋪一層脫脂棉。填充好的層析柱靜置24h后，輕敲柱壁，以除氣泡，再加2倍柱體積淋洗劑走柱子。

1.2.3.2 發(fā)酵液的分離 上樣，移取預處理過的發(fā)酵液緩慢滴加到層析柱中進行分離純化，使用自動部分收集器收集分離液，并用紫外可見分光光度計對分離液進行精確測定并繪制分離圖確定峰高H、峰寬D、峰高峰寬之比R。

1.2.4 實驗數據處理 利用單因素實驗對洗脫劑種類、洗脫劑配比、上樣液流速、發(fā)酵液上樣量四個參數進行初步確定，再采用Box－Behnken響應面分析法對不同參數組合進行優(yōu)化，因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素水平表

2 結果與討論

分離過程中，通過比較曲線的峰高峰寬之比R和出峰范圍內的葉酸總質量M來綜合評價分離條件的優(yōu)劣。

2.1 洗脫劑種類的選擇

固定上樣液流速為0.7m L/m in，發(fā)酵液上樣量為5m L，分別用甲醇、乙醇兩種洗脫劑對發(fā)酵液進行分離，確定最佳洗脫劑的種類，所得結果見表2。

表2 不同種類洗脫劑對洗脫效果的影響

由表2可以看出，洗脫劑選用甲醇和乙醇的分離效果差距不大。但由于甲醇比乙醇更易揮發(fā)，并有較強的毒性，不利于分離食用葉酸，由此洗脫劑種類選用乙醇。

2.2 洗脫劑配比的確定

固定上樣液流速為0.7m L/m in，發(fā)酵液上樣量固定為5m L，分別用乙醇和氨水不同配比的洗脫劑進行硅膠柱層析分離實驗，所得數據見表3。

表3 不同洗脫劑配比對洗脫效果的影響

由表3可知，洗脫劑中乙醇與氨水的比例為3∶1時，雖然峰寬D較大，但曲線峰高H、葉酸質量M均為最大，且與其余二組數據差距較大，分離純化得到的葉酸多，所以洗脫劑配比初步確定為乙醇∶氨水=3∶1。

2.3 洗脫劑流速的確定

固定發(fā)酵液上樣量為5m L，洗脫劑乙醇與氨水的比例為3∶1，調節(jié)不同上樣液流速進行分離，所得結果見表4。

表4 不同上樣液流速對洗脫效果的影響

由表4可以看出，流速為1.2m L/min時，曲線峰高H，峰高與峰寬比值R均為最大，葉酸質量M與流速為0.5m L/min或0.7m L/min時相差不大，起峰快且高，基本無拖尾現象，所以流速初步確定為1.2m L/min。

2.4 發(fā)酵液上樣量的確定

固定洗脫劑乙醇與氨水的比例為3∶1，上樣液流速為0.7m L/m in，調節(jié)不同發(fā)酵液上樣量進行分離，所得結果見表5。

表5 不同發(fā)酵液上樣量對洗脫效果的影響

由表5可知，發(fā)酵液上樣量為4m L時，峰高H和葉酸質量M僅低于5m L時的曲線，且曲線R值最大，無拖尾現象。而上樣量為5mL時R值太小，拖尾現象明顯，分離效果不佳，所以發(fā)酵液上樣量選用4m L。

2.5 Box－Behnken響應面分析

2.5.1 實驗設計與結果 以葉酸濃度為響應值，采用三因素三水平的Box－Behnken響應面分析法，其中包括12個析因點實驗，3個零點重復實驗用于估計實驗誤差。實驗結果如表6所示。

2.5.2 二次響應面回歸模型的建立 以葉酸濃度為響應值，根據表6中的實驗結果，采用SAS V8.0統計軟件對表6中實驗數據進行回歸分析，建立以葉酸質量M為響應值的全變量二次回歸方程，并進一步通過數據優(yōu)化程序求得當響應面值最大時的各參數最優(yōu)水平，所得方程如下:

表7 方差分析結果

表6 Box－Behnken實驗設計結果

方程回歸分析及方差分析見表7，響應面圖見圖1。由表7可知，回歸模型極顯著(Pmodel＜0.01)，失擬項在а=0.05水平上不顯著(P=0.121579＞0.05)，其決定系數R2=0.9854，表明該模型擬合程度良好，可以用于葉酸發(fā)酵液分離工藝優(yōu)化的理論預測。

從表 7 還可以看出 X1，X2，X3，X1X1，X2X2和X3X3為極顯著因素。由響應面立體分析圖可知，Y在一定三維變量區(qū)域內響應值Y存在最優(yōu)值。通過回歸方程可得知 X1、X2、X3優(yōu)化后的確切值，X1=－0.26072，X2=0.32280，X3= －0.38581，此時可使得回歸方程Y取得最大值:99.43905。由此可知，通過響應面法優(yōu)化后硅膠柱層析分離中的各參數為:上樣液流速 =1.26072m L/m in，發(fā)酵液上樣量 =5.2912m L，洗脫劑配比 =1.84257∶1。結合儀器的可操作性，優(yōu)化條件為上樣液流速為1.26m L/min，發(fā)酵液上樣量為 5.29m L，洗脫劑乙醇與氨水之比 =1.84∶1。

圖 1 Y=f(X1，X2)，Y=f(X1，X3)，Y=f(X2，X3)響應面立體分析圖

2.5.3 回歸模型的驗證實驗 為證實預測結果，用以上得到的最優(yōu)組合重復實驗3次，葉酸產量為(101.12±0.13)μg，預測值與實驗值之間良好的擬合性證實了該模型的有效性。并且峰高與峰寬比R較大，拖尾現象不明顯，所以該工藝參數可以很好地用于發(fā)酵液中葉酸的分離。

3 結論

硅膠柱法分離純化葉酸發(fā)酵液的最優(yōu)條件為:上樣液流速為1.26m L/m in，發(fā)酵液上樣量為5.29m L，洗脫劑乙醇∶氨水 =1.84∶1，所提取的葉酸質量為(101.12 ±0.13)μg。

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Study on separation and purification of folic acid from fermented broth by silica gel column chromatography

LIU Yan1，XUE Zheng－lian1，HU Liu－xiu2，LIU Shan－lin1，JIN Hua2

(1.College of Biochemistry Engineering，Anhui Polytechnic University，Microorganism Fermentation Engineering and Technology Research Center of Anhui Province，Wuhu 241000，China;
2.Wuhu Zhang Heng Chun Medicine CO.，LTD.，Wuhu 241009，China)

Fermented broth of Candida utilis Y2.12 was separated and purified by silica gel column chromatography.The elution effects with different kinds of eluents，proportion of twoeluents，flow rate and loading amount were studied.Based on single factor experiments，the proportion of ethanol and ammonia，flow rate，loading amount were analyzed by response surface methodology.The results showed that the optimal separation technological parameters were as follows:1.26m L/m in flow rate，5.29m L loading amount，1.84∶1 the proportion of ethanol and ammonia.The weight of extracted folic acid was(101.12 ±0.13)μg.

silica gel column;folic acid;separation;Candida utilis;response surface methodology

TS201.1

B

1002－0306(2011)08－0304－04

2010－08－05

劉艷(1981－)，女，講師，研究方向:食品加工。

國家教外司留(［2001］660);蕪湖市科技計劃項目(2008507);安徽工程大學重點青年基金項目(2007YQ006zd)。