張 靜，趙建新，陳海琴，陳 衛(wèi)，張 灝

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122)

高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的初步研究

張 靜，趙建新，陳海琴，陳 衛(wèi)，張 灝*

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122)

高山被孢霉具有很強(qiáng)的脂肪合成能力，并可積累多種多不飽和脂肪酸，為進(jìn)一步提高高山被孢霉多不飽和脂肪酸產(chǎn)量，對(duì)碳源、氮源等對(duì)高山被孢霉菌體生長(zhǎng)和多不飽和脂肪酸(PUFA)生產(chǎn)的影響進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明:甘油可以作為葡萄糖的替代物用于高山被孢霉工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸;當(dāng)脫脂豆粉與硝酸鉀的比例為2∶1時(shí)，此時(shí)菌體形態(tài)最利于脂肪酸生產(chǎn)，脂肪酸和花生四烯酸的產(chǎn)量分別為11.20g/L和5.89g/L，花生四烯酸的產(chǎn)量提高了4.0倍。

高山被孢霉，多不飽和脂肪酸，花生四烯酸

多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)指18碳以上含有兩個(gè)或兩個(gè)以上非共軛順式雙鍵的脂肪酸。主要包括亞油酸(LA)、α－亞麻酸(ALA)、γ－亞麻酸(GLA)、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。PUFA是生物膜的重要組成成分，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞構(gòu)型、相轉(zhuǎn)變及細(xì)胞膜的滲透性，同時(shí)是某些生物活性物質(zhì)的前體，如類二十烷、前列腺素、白三烯等，具有重要生理功能［1－4］。高山被孢霉具有很強(qiáng)的多不飽和脂肪酸合成能力，尤其是花生四烯酸，在英國(guó)、日本等國(guó)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，而在我國(guó)尚處于起步階段，產(chǎn)量有待于進(jìn)一步提高。高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸，其油脂存在于菌體內(nèi)，產(chǎn)量受菌體生物量，菌體中脂肪酸的比例和高附加值脂肪酸如AA、GLA、EPA等在脂肪酸中的比例三方面的影響。在提高生物量的同時(shí)，不同菌體形態(tài)會(huì)對(duì)發(fā)酵液的狀況有很大影響，進(jìn)而影響傳質(zhì)傳氧。本研究希望通過(guò)接種方式、碳源、氮源、攪拌速率的研究改善菌體形態(tài)，促進(jìn)發(fā)酵液中傳質(zhì)傳氧，提高脂肪酸的產(chǎn)量，為具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高山被孢霉(Mortierella alpinaATCC 32222)購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，由本研究中心保藏;脫脂豆粉 青島隆海食品有限公司，低溫豆粕加工;大豆油 眾友食品科技有限公司;酵母粉 Becton，Dickinson and Company;聚氧硅烷 賽歐信越X－ 680;脂肪標(biāo)準(zhǔn)品 Nu－Chek公司。

氣相色譜GC－2010 Shimadzu Co.，Japan。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基∶PDA培養(yǎng)基;種子培養(yǎng)基(g/L)∶葡萄糖30，酵母粉5，KNO32，NaH2PO41，MgSO4·7H2O 0.3，pH 6.3，115℃滅菌20min。發(fā)酵基本培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖50，脫脂豆粉31，大豆油1，KH2PO43，Na2SO41，CaCl2·2H2O 0.5，MgCl2·6H2O 0.5，pH 6.0，115℃滅菌20min。

1.2.2 培養(yǎng)方法 菌種活化∶將孢子接種于PDA斜面，20℃于霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d以上。種子培養(yǎng)∶向斜面培養(yǎng)基加入9mL種子培養(yǎng)基，輕刮孢子，以4%的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，20℃，200r/min培養(yǎng)3d(液體發(fā)酵在250mL三角瓶中進(jìn)行，每瓶裝液量45mL)。將培養(yǎng)至3d的菌體用分散器打散成均勻的菌體片段，以1g/L菌體片段接種于種子培養(yǎng)基中，20℃，200r/min培養(yǎng)36h，作為發(fā)酵用菌種。發(fā)酵培養(yǎng)∶250mL搖瓶培養(yǎng)裝發(fā)酵培養(yǎng)基50mL，回轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速200r/min，溫度20℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高山被孢霉菌體生物量的測(cè)定 全發(fā)酵液先用布氏漏斗真空抽濾分離發(fā)酵液和菌體，再用蒸餾水洗滌3遍，得到的菌體放入－80℃超低溫冰箱中過(guò)夜，然后進(jìn)行冷凍干燥得到干菌體，冷凍干燥程序?yàn)椤檬紫纫?.5℃/min由室溫降至－40℃，預(yù)凍40h，然后以0.15℃/min由－40℃升溫至－25℃并保持9h，再以 0.15℃/min由－25℃升溫至－10℃;繼而以0.3℃/min由－10℃升溫至25℃并保持4h，最后以0.5℃/min至室溫保持4h。每升發(fā)酵液中干菌體的重量即為菌體生物量。

1.3.2 高山被孢霉菌體中脂肪酸組成及含量的測(cè)定稱取(0.0600±0.0004)g高山被孢霉菌體，加入1mg/ mL的17∶1脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品200μL，采用B＆D法［5］提取粗脂質(zhì);在提取出的粗脂質(zhì)中加入1mL 0.5mol/L KOH－MeOH溶液，70℃水浴30min，然后加入2mL 25%(v/v)BF3－MeOH溶液，70℃水浴20min進(jìn)行脂肪酸甲酯化，水浴后加入正己烷2mL，飽和氯化鈉溶液4mL，分離得到脂肪酸甲酯溶液。脂肪酸甲酯分析采用氣相色譜 GC－2010，色譜柱為 DB－Waxetr (30m×0.32mm，0.25μm)。氫火焰離子檢測(cè)器檢測(cè)，汽化室和檢測(cè)器溫度分別為250℃和260℃，分流方式進(jìn)樣1μL，分流比10∶1，載氣為氮?dú)?。程序升溫∶初始溫?20℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以1℃/min升到210℃，保持15min。高山被孢霉中脂肪酸甲酯氣相色譜分離圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 高山被孢霉中脂肪酸甲酯氣相色譜圖

1.3.3 其他測(cè)定 還原糖測(cè)定采用DNS法［6］;含氮量測(cè)定采用微量凱式定氮法GB/T 5009.5－2003。

2 結(jié)果與討論

2.1 高山被孢霉生長(zhǎng)過(guò)程分析

高山被孢霉在發(fā)酵基本培養(yǎng)基中20℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)168h，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、脂肪酸生成曲線、殘?zhí)呛蜌埖€，如圖2所示。高山被孢霉在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中主要分為四個(gè)階段。第一階段(0～12h)，細(xì)胞生長(zhǎng)處于延滯期，培養(yǎng)液中固態(tài)的脫脂豆粉逐漸水解為液態(tài)。第二階段(12～72h)，葡萄糖和脫脂豆粉大量消耗，菌體的生物量迅速增加，隨細(xì)胞生長(zhǎng)單位菌體中脂肪酸含量增加并逐漸趨于穩(wěn)定達(dá)13.8%。第三階段(72～120h)，發(fā)酵液中可利用氮源逐漸耗盡，葡萄糖消耗速率減緩由對(duì)數(shù)期的11g/L· d降至5g/L·d，菌體中脂肪酸的比例開(kāi)始大幅度的增加。在氮源充足時(shí)轉(zhuǎn)化效率為11g脂肪酸/100g葡萄糖，當(dāng)?shù)慈狈r(shí)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到18g脂肪酸/ 100g葡萄糖，因此氮源缺乏時(shí)葡萄糖可以更高效地用于脂積累，但與理論值32g脂肪酸/100g葡萄糖有一定的差距［7］。第四階段(144～168h)，發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源和葡萄糖均已耗盡，生物量迅速減少。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間下高山被孢霉單位菌體脂肪酸組成分析

很多微生物趨于以脂質(zhì)形式貯存它們獲得的能量，因此有必要研究培養(yǎng)時(shí)間對(duì)高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)的脂肪酸組成的影響。單位菌體中的脂肪酸組成情況見(jiàn)圖3，各種脂肪酸的產(chǎn)量隨菌體所處的生長(zhǎng)階段的不同而發(fā)生改變。AA在不同的生長(zhǎng)階段的脂積累情況為∶當(dāng)?shù)闯渥銜r(shí)，AA隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)緩慢的增加;當(dāng)無(wú)可利用氮源時(shí)，細(xì)胞停止生長(zhǎng)，AA隨FA的大幅度增加而大量積累，由最初的7.7%經(jīng)過(guò)了7d的培養(yǎng)達(dá)到最大值25.9%，單位菌體中AA含量從培養(yǎng)的第4d開(kāi)始大量增加的同時(shí)伴隨著主要是亞油酸含量的減少。EPA在不同生長(zhǎng)階段的脂積累情況∶在整個(gè)生長(zhǎng)階段EPA含量較低，在第4d達(dá)到最大值僅有0.637mg/g干菌體。硬脂酸和軟脂酸等飽和脂肪酸在氮源耗盡后在總脂肪酸中的比例開(kāi)始大幅增加，在葡萄糖耗盡后降低。硬脂酸、軟脂酸等脂肪酸在第6～7d開(kāi)始緩慢下降，其可能原因是培養(yǎng)基中無(wú)可利用的葡萄糖，菌體通過(guò)分解自身的部分脂肪酸來(lái)獲得生長(zhǎng)所需要的能量。Ratledge等研究表明，當(dāng)?shù)闯渥銜r(shí)，葡萄糖進(jìn)入三羧酸循環(huán)，產(chǎn)油微生物利用進(jìn)行菌體生長(zhǎng)，PUFA為初級(jí)代謝產(chǎn)物且產(chǎn)量與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)，因此氮源充足時(shí)PUFA隨菌體生長(zhǎng)在總脂肪酸中比例略有增加;當(dāng)培養(yǎng)基中無(wú)可利用氮源時(shí)，產(chǎn)油微生物能夠?qū)⑹Ｓ嗟奶荚炊加行У剞D(zhuǎn)化為了脂肪酰CoA，最終形成三酰甘油酯，從而可以解釋脂肪酸的大幅度增加［7］。2.3 接種量的確定

圖2 高山被孢霉的生長(zhǎng)曲線

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間下高山被孢霉單位菌體中脂肪酸的組成情況

高山被孢霉產(chǎn)孢子量只能達(dá)到104，且存在孢子萌發(fā)情況不一的問(wèn)題，為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果可在合作方實(shí)驗(yàn)室重現(xiàn)，需要建立高山被孢霉接種的標(biāo)準(zhǔn)化方法。因此我研究中心以菌體濕重作為接種量的衡量標(biāo)準(zhǔn)，建立了菌體打碎后定時(shí)生長(zhǎng)、定量接種來(lái)實(shí)現(xiàn)菌種的標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)方法。在菌體打碎后，分別以1、2、4、6g/L菌體濕重接種于種子培養(yǎng)基，然后再以10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，研究不同接種方式對(duì)于高山被孢霉菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。不同菌球直徑的菌體接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，菌體生物量沒(méi)有顯著性差異，隨著接入菌球直徑的減小，AA產(chǎn)量增加。同時(shí)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，接入小直徑菌球培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速率大于接入大菌球的培養(yǎng)物，隨培養(yǎng)的進(jìn)行，培養(yǎng)菌體形態(tài)的差異性逐漸變小?？赡艿脑蚴牵囵B(yǎng)初期，由于只有菌球外部菌絲體具有生長(zhǎng)的能力，因而小菌球的生長(zhǎng)速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大菌球。培養(yǎng)過(guò)程中，菌絲體斷裂，形成新的生長(zhǎng)點(diǎn)，而發(fā)酵培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)豐富，后期培養(yǎng)物差異性逐漸變小。Higashiyama對(duì)于高山被孢霉的研究表明1～2mm菌球直徑的菌體最利于AA生產(chǎn)［8］。綜上，采用6g/L濕菌接種于種子培養(yǎng)基。

表1 不同接種量對(duì)高山被孢霉細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的影響

2.4 不同碳源對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的影響

分別以5%的非糧食來(lái)源甘油和木糖作為唯一碳源，研究不溶碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。從表2中我們可以看出，葡萄糖為最佳碳源，同時(shí)高山被孢霉能很好地利用甘油進(jìn)行脂積累，菌體生物量為31.6g/L，略低于葡萄糖的39.2g/L。在生物油脂的生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的粗甘油，粗甘油用于單細(xì)胞油脂生產(chǎn)可以直接進(jìn)入提取步驟，而提取是單細(xì)胞油脂加工工藝中成本最高的一項(xiàng)［9］。因此，以甘油替代或部分替代葡萄糖作為高山被孢霉工業(yè)化生產(chǎn)的原料，將大大降低生產(chǎn)成本，這有待于進(jìn)一步研究。

表2 不同碳源對(duì)高山被孢霉細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的影響

2.5 復(fù)合氮源比例的確定

PUFA是胞內(nèi)產(chǎn)物，在PUFA的商業(yè)化生產(chǎn)中提高PUFA產(chǎn)量需要提高菌體濃度。有機(jī)氮源脫脂豆粉有利于高山被孢霉細(xì)胞生長(zhǎng)，但羽狀的菌絲體大大增加了發(fā)酵液的粘稠度，影響了氧和養(yǎng)分的傳遞和發(fā)酵液的均一性［10］。Jang等研究表明KNO3是用于AA和PUFA生產(chǎn)的最佳無(wú)機(jī)氮源，鉀離子有助于硝酸根的吸收［11］。因此，希望通過(guò)以無(wú)機(jī)氮源部分替代有機(jī)氮源來(lái)降低發(fā)酵液的粘稠度，同時(shí)可以降低生產(chǎn)成本。

由表3可知，通過(guò)改變脫脂豆粉和KNO3的比例，培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)菌體形態(tài)、非脂生物量和脂肪酸組成有較大差異。隨KNO3比例的增加，菌絲體形態(tài)分別呈現(xiàn)羽狀、大的菌團(tuán)，表面逐漸光滑的菌球。當(dāng)有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源的比例為5∶1時(shí)，菌體形成一個(gè)大的菌團(tuán)，生物量大幅度下降到25.6g/L，下降了32%，脂肪酸產(chǎn)量也隨之下降。其他不同氮源配比的高山被孢霉菌均形成小菌球，隨著KNO3比例的提高，發(fā)酵液的粘稠度降低，AA的含量增加。造成這種差異可能的原因是∶不同配比的氮源改變了菌體表面的電荷狀況從而造成菌體形態(tài)的差異。細(xì)胞壁電斥力和細(xì)胞聚集與分散水平有關(guān)系，在根霉［12］和釀酒酵母［13］的培養(yǎng)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)。菌體形態(tài)的改變可影響菌體對(duì)于營(yíng)養(yǎng)和氧的攝入，當(dāng)菌球半徑超過(guò)一定的值時(shí)，密實(shí)菌球區(qū)域可能受到培養(yǎng)基的限制而抑制生長(zhǎng)。Hamanaka等采用FITC異硫氰酸熒光素和尼羅紅對(duì)高山被孢霉菌球進(jìn)行染色分析菌絲中脂質(zhì)體的分布，發(fā)現(xiàn)菌絲內(nèi)部中心為一空穴，而脂存在于菌球邊緣菌絲密集處［14］。中心的空腔是由于長(zhǎng)期處于營(yíng)養(yǎng)和氧氣匾乏狀態(tài)下死亡自溶而導(dǎo)致的。當(dāng)菌體形態(tài)呈分散均勻的小球時(shí)，隨KNO3比例的增加每克非脂生物量所需要的豆粕粉的量減少，由此可見(jiàn)KNO3以適宜的比例替代豆粕粉有助于非脂生物量的提高。當(dāng)有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源比例為2∶1時(shí)，脂肪酸產(chǎn)量、AA和 EPA大幅度提高分別為11.97、5.06g/L和38mg/L(表3)，分別提高了0.38、3.29和0.31倍。因此，當(dāng)脫脂豆粉與KNO3比例為2∶1時(shí)有利于高山被孢霉脂肪酸的生產(chǎn)。

表3 不同氮源比例對(duì)高山被孢霉生物量和FA、AA和EPA產(chǎn)量的影響

表4 高山被孢霉各脂肪酸組成

2.6 攪拌速率的確定

高山被孢霉為好氧性絲狀真菌，在培養(yǎng)過(guò)程中需要通過(guò)攪拌槳來(lái)使氣體分散提供滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的需要，同時(shí)菌體在攪拌槳剪切力的作用下菌絲體斷裂，斷裂的菌絲體片段形成新的生長(zhǎng)點(diǎn)繼續(xù)生長(zhǎng)，因此不同的攪拌速率將形成不同的菌體形態(tài)，影響到細(xì)胞生長(zhǎng)和脂肪酸的產(chǎn)量。本研究采用六直葉攪拌槳，去除擋板(菌絲體在發(fā)酵的過(guò)程中易附著在擋板上進(jìn)行生長(zhǎng)，故去除擋板)分別選取了100、200、300r/min三個(gè)攪拌速度進(jìn)行研究。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液中細(xì)胞濃度不斷增加，在使用100r/min培養(yǎng)時(shí)，靠近發(fā)酵罐罐壁有大量菌體形成團(tuán)狀，影響了發(fā)酵液中養(yǎng)料和氧的傳遞。當(dāng)攪拌速率為200或300r/min時(shí)，菌體可以很好地分散成均勻的小球，為了減少攪拌過(guò)程中對(duì)菌體的傷害，選擇200r/min。

2.7 3L發(fā)酵罐批發(fā)酵放大實(shí)驗(yàn)

在前期搖瓶培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用3L發(fā)酵罐進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，裝液量為1.5L，通氣量為0.5vvm，攪拌速率200r/min，采用自動(dòng)消泡，消泡劑為聚氧硅烷。脫脂豆粉20g/L，KNO310 g/L，其他同基本培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)6d發(fā)酵，菌體生物量為34.9g/L，F(xiàn)A和AA分別為11.20、5.89g/L，各脂肪酸組成見(jiàn)表4。

3 結(jié)論

本研究首先對(duì)高山被孢霉在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性進(jìn)行了研究，氮源耗盡前后葡萄糖轉(zhuǎn)化為脂肪酸的效率分別為11%和18%。采用基本發(fā)酵培養(yǎng)基菌體形態(tài)為放射羽狀，菌體生物量達(dá)到39g/L，但發(fā)酵液粘稠度大，不利于傳質(zhì)傳氧。研究采用6g濕菌體每升發(fā)酵液接種，KNO3替代脫脂豆粉1∶2(w/w)，200r/min的攪拌速率，發(fā)酵過(guò)程中的菌體形態(tài)為更利于傳質(zhì)傳氧的毛絨小球，菌體生物量為34.9g/L，F(xiàn)A和AA分別為11.20、5.89g/L，其中AA產(chǎn)量提高了約4.0倍。

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The preliminary study of fermentation conditions for polyunsaturated fatty acids production by Mortierella aplina

ZHANG Jing，ZHAO Jian－xin，CHEN Hai－qin，CHEN Wei，ZHANG Hao*
(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China)

Mortierella alpina yielded high amount of lipid and many kinds of fatty acids.To improve the production of polyunsaturated fatty acids，the effect of carbon source，nitrogen source on the polyunsaturated fatty acids(PUFA) contents of Mortierella alpina were studied.The results showed that glycerine could be used as a substitute for glucose for Mortierella alpina industrial production of PUFA.When the ratio of defatted soybean powder and KNO3reached 2∶1，it improved dry cell weight productivity and fatty acids contents in cell，fatty acids and AA productivity reached 11.20g/L and 5.89g/L，AA productivity increased by 4.0 times.

Mortierella alpina;polyunsaturated fatty acids;arachidonic acid

TS201.3

A

1002－0306(2011)11－0216－04

2010－10－18 *通訊聯(lián)系人

張靜(1985－)，女，碩士研究生，主要從事油脂微生物方面的研究。