包鵬舉， 戚仁斌， 王海華△， 張根葆， 胡錢(qián)國(guó)， 孫 瑤

(皖南醫(yī)學(xué)院 1生理教研室，2蛇毒研究所，安徽 蕪湖 241002；3暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510532)

銀杏達(dá)莫注射液對(duì)高鉀血癥大鼠離體血管張力的影響*

包鵬舉1,2， 戚仁斌3， 王海華1,2△， 張根葆2， 胡錢(qián)國(guó)1,2， 孫 瑤2

(皖南醫(yī)學(xué)院1生理教研室，2蛇毒研究所，安徽 蕪湖 241002；3暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510532)

目的觀(guān)察銀杏達(dá)莫注射液(GD)對(duì)高鉀血癥大鼠離體胸主動(dòng)脈的影響，并探討其可能作用機(jī)制。方法復(fù)制高鉀血癥大鼠模型，制備離體胸主動(dòng)脈環(huán)，經(jīng)生物信號(hào)與采集分析系統(tǒng)測(cè)定主動(dòng)脈環(huán)的張力變化。觀(guān)察不同濃度GD(4、8、16 mg/L)預(yù)孵育的高鉀血癥大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)去氧腎上腺素(PE)和KCl收縮張力的影響。結(jié)果與正常大鼠相比，高鉀血癥大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)對(duì)PE和KCl收縮張力明顯升高(P<0.05)。不同濃度GD對(duì)基礎(chǔ)張力無(wú)明顯影響(P>0.05)。在內(nèi)皮完整主動(dòng)脈環(huán)上，GD預(yù)孵育后對(duì)KCl收縮張力無(wú)明顯影響(P>0.05)；而16 mg/L GD預(yù)孵育后對(duì)PE收縮張力有明顯抑制作用(P<0.05)，此作用可被一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)或鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍(lán)(MB)所抑制。在去內(nèi)皮的主動(dòng)脈環(huán)上，不同濃度GD預(yù)孵育后對(duì)PE收縮張力無(wú)顯著作用(P>0.05)。結(jié)論GD對(duì)高鉀血癥大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)具有內(nèi)皮依賴(lài)性舒張作用，其機(jī)制可能與激活血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮-鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶途徑有關(guān)。

銀杏葉提取物; 雙嘧達(dá)莫； 高鉀血癥； 主動(dòng)脈

高鉀血癥是慢性腎功能衰竭和糖尿病酮癥酸中毒等臨床疾病常見(jiàn)且危重的并發(fā)癥之一，若不及時(shí)處理則會(huì)加重血管病變(內(nèi)皮損傷等)和心肌毒性而危及生命[1,2]。銀杏達(dá)莫注射液(Ginkgoleaf extract and dipyridamole injection,GD)為我國(guó)第4代銀杏葉提取物加入雙嘧達(dá)莫的復(fù)合制劑，臨床上因其具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)血管張力、改善機(jī)體代謝及末梢血液循環(huán)障礙等作用而主要用于治療血管性癡呆、腦梗死、糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變等疾病[3-5]。然而，目前關(guān)于銀杏達(dá)莫注射液對(duì)高鉀血癥離體血管的直接作用尚缺乏研究，其機(jī)制亦尚未明了。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)灌流方法，觀(guān)察銀杏達(dá)莫注射液對(duì)高鉀血癥大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)張力的影響，并探討其可能作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠，雌雄不限，體重(220±30)g，由皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(浙)20080033。

1.2主要試劑和儀器 銀杏達(dá)莫注射液為貴州益佰藥廠(chǎng)產(chǎn)品，規(guī)格：安瓿瓶包裝，5 mL/瓶。批號(hào)為20081104。去氧腎上腺素(phenylephrine，PE)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、左旋硝基精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)、亞甲藍(lán)(methylene blue，MB)均為Sigma產(chǎn)品。Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol·L-1)：NaCl 118、KCl 4.7、KH2PO41.2、MgSO41.2、NaHCO325、glucose 5.5、CaCl22.5。離體血管環(huán)灌流裝置和Medlab/8C生物信號(hào)采集系統(tǒng)購(gòu)自南京美易科技公司；張力傳感器(JZ101型)購(gòu)自河北高碑店市新航機(jī)電設(shè)備有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2方法

2.1高鉀血癥動(dòng)物模型 參照董雅潔等[6]模型復(fù)制方法，大鼠稱(chēng)重后用20%氨基甲酸乙酯溶液(6 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定在大鼠手術(shù)臺(tái)上。用針型心電電極分別插入大鼠四肢皮下，導(dǎo)聯(lián)線(xiàn)輸入端接入Medlab/8C生物信號(hào)采集系統(tǒng)，描記正常麻醉狀態(tài)下的Ⅱ?qū)?lián)心電圖。選擇大鼠下腹部右或左側(cè)部位注射10%KCl生理鹽水溶液，首次選擇按4 mL·kg-1BW的劑量注射，觀(guān)察心電圖波形15 min。以大鼠出現(xiàn)明顯的高鉀血癥異常心電圖波形視為模型復(fù)制成功。

2.2大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的制備與穩(wěn)定 大鼠頸椎脫臼致死，迅速開(kāi)胸，游離主動(dòng)脈胸腹段，置于通以95% O2+5% CO2混合氣體的4 ℃K-H液的平皿中，清除血污，仔細(xì)剔除周?chē)Y(jié)締組織，剪成約3-4 mm長(zhǎng)的動(dòng)脈環(huán)，避免過(guò)度牽拉，以防損傷血管。去除血管內(nèi)皮時(shí)，用棉簽?zāi)ゲ林鲃?dòng)脈環(huán)內(nèi)表面以去除內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將動(dòng)脈環(huán)懸掛于含K-H液的浴槽內(nèi)，血管兩端分別連于張力傳感器和浴槽底部的不銹鋼絲，使用Medlab/8C生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄血管張力。動(dòng)脈環(huán)先以0 g張力起步，穩(wěn)定30 min，逐步調(diào)節(jié)至最適張力1.5 g，平衡1 h后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，期間每15 min換液1次，浴槽內(nèi)持續(xù)通以95% O2+5% CO2混合氣體并保持恒溫37℃。動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定后，用60 mmol·L-1KCl刺激達(dá)峰值，然后用K-H液洗脫至基線(xiàn)，重復(fù)3次，以激發(fā)主動(dòng)脈環(huán)最大收縮幅度。待動(dòng)脈環(huán)重新穩(wěn)定后，浴槽中加入10-6mol·L-1PE，收縮達(dá)峰值穩(wěn)定后，加入10-5mol·L-1ACh，檢驗(yàn)血管內(nèi)皮完整性。若加ACh后使PE預(yù)收縮的血管舒張60%-90%則可認(rèn)為內(nèi)皮完整；反之，則認(rèn)為內(nèi)皮被破壞[7]。

以10-6mol·L-1PE或60 mmol·L-1KCl誘發(fā)的最大收縮幅度為100%，以加入藥物后的血管張力幅度與PE或KCl誘發(fā)的最大收縮幅度之間的比例反映血管張力的變化[6]。

2.3離體實(shí)驗(yàn)分組及處理 實(shí)驗(yàn)分為4組，每組8只大鼠。 (1)PE和KCl對(duì)主動(dòng)脈環(huán)張力的影響組：分別觀(guān)察間隔5 min累積濃度為10-8-10-5mol·L-1PE和12-60 mmol·L-1KCl對(duì)高鉀血癥大鼠主動(dòng)脈環(huán)張力的影響，記錄張力變化；以正常大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)作為對(duì)照組。(2)GD對(duì)高鉀血癥大鼠主動(dòng)脈環(huán)基礎(chǔ)張力的影響組：采用累積加藥法，使浴槽中的GD終濃度分別達(dá)4、8、16 mg/L，記錄張力變化；對(duì)照組以K-H液等容加入。(3)不同濃度GD預(yù)孵育對(duì)主動(dòng)脈環(huán)張力的影響組：分別用不同濃度GD(4、8、16 mg/L)預(yù)孵育高鉀血癥大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)20 min后，觀(guān)察間隔5 min累積給予10-8-10-5mol·L-1PE和12-60 mmol·L-1KCl對(duì)主動(dòng)脈環(huán)張力的影響，記錄張力變化；對(duì)照組以K-H液等容加入預(yù)孵育。(4)不同抑制劑預(yù)處理后GD對(duì)主動(dòng)脈環(huán)張力的影響組：先用一氧化氮合酶抑制劑L-NAME(10-4mol·L-1)或鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶抑制劑MB(10-5mol·L-1)孵育高鉀血癥大鼠離體內(nèi)皮完整胸主動(dòng)脈環(huán)20 min，再加入不同濃度GD共同孵育20 min后，觀(guān)察其對(duì)10-8-10-5mol·L-1PE收縮的主動(dòng)脈環(huán)張力的影響，記錄張力變化；對(duì)照組以K-H液等容加入預(yù)孵育。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1PE和KCl對(duì)主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

分別使用累積濃度為10-8-10-5mol·L-1PE和12-60 mmol·L-1KCl處理后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)高鉀血癥大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)收縮張力明顯高于正常大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)收縮張力，二者差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1PE和KCl對(duì)高鉀血癥大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

2GD對(duì)高鉀血癥大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)基礎(chǔ)張力的影響

累積給予4、8、16 mg/L GD對(duì)高鉀血癥大鼠離體主動(dòng)脈環(huán)基礎(chǔ)張力無(wú)明顯影響(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2GD對(duì)高鉀血癥大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)基礎(chǔ)張力的影響

3不同濃度GD預(yù)孵育對(duì)主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度GD(4、8、16 mg/L)預(yù)孵育后的高鉀血癥大鼠主動(dòng)脈環(huán)對(duì)KCl收縮未見(jiàn)明顯張力變化(P>0.05)，見(jiàn)表1。但16 mg/L GD預(yù)孵育后對(duì)PE收縮的內(nèi)皮完整主動(dòng)脈環(huán)張力則明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖3A。而在去內(nèi)皮主動(dòng)脈環(huán)上則不能產(chǎn)生明顯的舒張作用(P>0.05)，見(jiàn)圖3B。

表1不同濃度GD預(yù)孵育后對(duì)KCl收縮主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

GroupKCl(mmol·L-1)12243660HKR10.50±2.2740.56±8.6592.05±18.00110.74±12.77HKR+4mg/LGD10.54±1.4841.24±15.9385.68±7.88114.60±13.13HKR+8mg/LGD9.64±1.0833.38±4.3984.60±6.85115.98±10.48HKR+16mg/LGD9.19±0.2237.17±6.6587.74±13.05103.64±7.38

圖3不同濃度GD預(yù)孵育后對(duì)PE收縮主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

4不同抑制劑預(yù)處理后GD對(duì)主動(dòng)脈環(huán)張力的作用

先用L-NAME(10-4mol·L-1)或MB(10-5mol·L-1)孵育血管環(huán)20 min，再加入不同濃度GD共同孵育20 min后，發(fā)現(xiàn)4 mg/L和8 mg/L GD組均對(duì)PE收縮的內(nèi)皮完整主動(dòng)脈環(huán)張力無(wú)明顯影響，而16 mg/L GD組對(duì)PE收縮的內(nèi)皮完整主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用則明顯被抑制(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2L-NAME或MB預(yù)處理后對(duì)16mg/LGD舒血管效應(yīng)的影響

GroupPhenylephrine(mol·L-1)10-810-710-610-5HKR12.55±3.84*44.72±4.57*110.20±1.56**150.29±9.37**HKR+16mg/LGD5.75±1.7526.48±3.4371.95±6.01101.92±10.54HKR+L-NAME+16mg/LGD28.19±1.34*47.71±1.44*109.35±1.73**145.60±9.49**HKR+MB+16mg/LGD23.45±1.49*52.24±2.14*107.77±5.39**141.12±6.94**

*P<0.05,**P<0.01vsHKR+16 mg/L GD group.

討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高鉀血癥大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)對(duì)PE和KCl刺激收縮的張力都明顯高于正常大鼠，而高鉀血癥臨床早期主要表現(xiàn)為肢體麻木蒼白、極度疲乏及肌肉酸痛等，推測(cè)這可能與高血鉀刺激血管收縮有關(guān)。

銀杏達(dá)莫注射液(杏丁注射液)為我國(guó)第4代銀杏葉提取物并在此基礎(chǔ)上加入雙嘧達(dá)莫的復(fù)合制劑, 其主要有效成分為: 銀杏黃酮甙(24%)、銀杏苦內(nèi)酯(3.1%)、白果內(nèi)酯(2.9%)、雙嘧達(dá)莫(10%)[3]。由于銀杏達(dá)莫具有保護(hù)血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)血管張力、降低血管阻力、改善機(jī)體代謝及末梢血液循環(huán)障礙等作用，加之隨著現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)對(duì)其藥理作用研究的深入，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床治療心力衰竭、糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變等疾病。而銀杏達(dá)莫注射液對(duì)高鉀血癥血管的直接作用尚缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)在觀(guān)察銀杏達(dá)莫注射液對(duì)高鉀血癥大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)主動(dòng)脈環(huán)的基礎(chǔ)張力無(wú)明顯影響；對(duì)PE刺激收縮的內(nèi)皮完整血管環(huán)具有顯著的舒張作用，而在去內(nèi)皮血管環(huán)上僅表現(xiàn)為微弱的舒張作用。故推測(cè)銀杏達(dá)莫注射液在調(diào)節(jié)高鉀血癥大鼠血管環(huán)張力的過(guò)程中，血管內(nèi)皮可能扮演了重要角色。

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，運(yùn)用一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯或可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)抑制劑亞甲藍(lán)預(yù)處理后，可阻斷銀杏達(dá)莫注射液的內(nèi)皮依賴(lài)性舒血管作用。而依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一氧化氮(nitric oxide ，NO)為血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的強(qiáng)效血管舒張因子，NO在內(nèi)皮NOS的作用下由左旋精氨酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，并通過(guò)激活平滑肌細(xì)胞sGC, 增加環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cyclie guanosine monophosphate，cGMP)含量而使血管平滑肌舒張；后者主要通過(guò)cGMP依賴(lài)性蛋白激酶使鈣內(nèi)流減少，增加鈣ATP酶對(duì)鈣的攝取或直接作用于收縮蛋白去磷酸化而使血管舒張[8]，因此推測(cè)NO-sGC-cGMP途徑可能介導(dǎo)了銀杏達(dá)莫注射液的內(nèi)皮依賴(lài)性舒血管作用。

此外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，銀杏達(dá)莫注射液對(duì)KCl收縮的內(nèi)皮完整高鉀血癥大鼠血管環(huán)無(wú)明顯影響。既往研究認(rèn)為，雖然PE和KCl都可引起血管收縮，但PE誘導(dǎo)的血管收縮是由α1-腎上腺素能受體的激活引起的，主要是通過(guò)三磷酸肌醇(1, 4, 5-triphosphate inositol)刺激平滑肌細(xì)胞內(nèi)貯鈣的釋放[9]。KCl則通過(guò)平滑肌細(xì)胞超極化而刺激血管收縮，其機(jī)制主要是使鈣離子通道開(kāi)放，細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，從而增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度[10]。因此，銀杏達(dá)莫注射液舒張血管環(huán)還可能與其直接抑制血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存鈣的釋放有關(guān)，但這還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，銀杏達(dá)莫注射液對(duì)高鉀血癥大鼠血管具有內(nèi)皮依賴(lài)性舒張作用，其機(jī)制可能與激活血管內(nèi)皮NO-sGC途徑有關(guān)，而其確切機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。

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EffectsofGinkgoleafextractanddipyridamoleinjectionontensionofthoracicaortaringsofratswithhyperkalemia

BAO Peng-ju1, 2, QI Ren-bing3, WANG Hai-hua1, 2, ZHANG Gen-bao2, HU Qian-guo1, 2, SUN Yao2

(1DepartmentofPhysiology;2InstituteofSnakeVenom,WannanMedicalUniversity,Wuhu241002,China;3DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510532,China.E-mail:wanghaihua9972@sina.com)

AIM: To investigate the effects ofGinkgoleaf extract and dipyridamole injection (GD) on the tension of thoracic aorta rings isolated from hyperkalemia rats(HKR).METHODSAfter the model of HKR was established and the preparation of the thoracic aorta rings was made, the tension of the rings was measured by a biological signal analytical system. The thoracic aorta rings were exposed to the medium containing GD at different concentrations and the vaso-constrictive tension was observed after stimulated with phenylephrine (PE) or KCl.RESULTSStimulated with PE or KCl, the tension of the thoracic aorta rings in HKR group was significantly higher than that in normal group (P<0.05). GD at the concentrations used in the experiment did not affect the basal tension in the resting rings prepared from both HKR and normal rats. In HKR group, pretreatment of the endothelium-intact thoracic aorta rings with GD at different concentrations showed no significant effect on KCl-induced vessel constriction (P>0.05). However, GD at the concentration of 16 mg/L significantly attenuated the vessel constriction induced by PE (P<0.05), which was inhibited by the pretreatment with Nω-nitro-L-arginine methylester or methylene blue. GD at different concentrations did not show significantly inhibitory effect on PE-induced tension of endothelium-denuded thoracic aorta rings in HKR group (P>0.05).CONCLUSIONGD causes endothelium-dependent relaxation in the thoracic aorta rings of HKR. This effect may be mediated by the nitricoxide-guanylyl cyclase pathway.

Ginkgobilobaextract; Dipyridamole; Hyperkalemia; Aorta

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.010

1000-4718(2011)01-0052-04

2010-06-11

2010-11-27

暨南大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助項(xiàng)目(No.2009ZD002)；安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究基金項(xiàng)目(KJ2007B022)

△通訊作者 Tel:0553-3866058; E-mail：wanghaihua9972@sina.com