林 琨， 藍(lán)云鋒， 方 舟, 高進(jìn)遼, 王紅娟, 李 泱△

(解放軍總醫(yī)院1心血管內(nèi)科，2老年心血管病研究所，北京 100853)

老齡大鼠心房肌細(xì)胞起搏電流的特征*

林 琨1， 藍(lán)云鋒2， 方 舟2, 高進(jìn)遼2, 王紅娟2, 李 泱2△

(解放軍總醫(yī)院1心血管內(nèi)科，2老年心血管病研究所，北京 100853)

目的研究老齡大鼠心房肌細(xì)胞起搏電流(If)的特征，探討其可能參與心房顫動(dòng)的機(jī)制。方法選擇22-24月齡SD大鼠分離心房肌細(xì)胞，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄If。結(jié)果約85%的老齡大鼠心房肌細(xì)胞可以記錄到的超極化激活I(lǐng)f，在-150 mV時(shí)，If的電流幅值約為(382±23)pA，電流密度約為(3.2±0.4)pA/pF。而青年大鼠只有40%的心房肌細(xì)胞記錄到If的電流幅值約為(86.9±8.4)pA，電流密度約為(0.9±0.1)pA/pF。從I-V曲線可見(jiàn)，老齡大鼠隨著超極化電位的增加，電流增加幅度明顯加快。在-150 mV時(shí)，其激活時(shí)間常數(shù)(τ)為(230.2±14.4)ms，而青年對(duì)照組心房肌細(xì)胞的τ則為(670.5±23.6)ms。此外，老齡大鼠心房肌細(xì)胞電流的半激活電壓為(-87.2±2.3)mV，明顯向更正的電位方向移動(dòng)，而青年鼠細(xì)胞的半激活電壓為(-104.4±6.3)mV，這使得老齡鼠的起搏電流更易激活。相反，二者的翻轉(zhuǎn)電位和激活曲線斜率差異不大。結(jié)論老齡大鼠心房肌細(xì)胞起搏電流的密度和激活均高于青年鼠。

老齡大鼠； 心房肌細(xì)胞； 起搏電流

老年人心臟由于物質(zhì)的改變或結(jié)構(gòu)的老化，致使許多功能發(fā)生改變。其中電生理改變則是老化心臟表現(xiàn)的主要特征之一。在老年患者中，由于異位節(jié)律誘發(fā)的心房顫動(dòng)占有很大的比例[1-3]。而異位節(jié)律的產(chǎn)生又與起搏電流((pacemaker current，If)有著密切的關(guān)系。If電流是一種去極化的鈉、鉀混合非特異電流,主要參與心臟起搏細(xì)胞4期自動(dòng)除極。If活動(dòng)增加,心肌組織自律性增加,容易導(dǎo)致快速心律失常[4]。目前發(fā)現(xiàn)心臟非起搏細(xì)胞同樣存在此電流。是否此電流同樣在房顫的發(fā)生中有作用值得探討。且老年心房肌細(xì)胞起搏電流的特征如何也鮮有報(bào)道。因此，本文利用膜片鉗技術(shù)研究了老齡大鼠心房肌細(xì)胞起搏電流及其特點(diǎn),為老年人房性心律失常的機(jī)制研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1試劑與溶液

膠原酶I 、蛋白酶E、牛血清白蛋白、MgATP、HEPES、CaCl2、BaCl2、CsCl、CdCl2、異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)、4-AP均為Sigma產(chǎn)品；EGTA購(gòu)自Fluka Biochemika ；其它試劑均為分析純。

1.1臺(tái)氏液成分(mmol/L) NaCl 135, KCl 5.4, CaCl21.8, MgCl21, NaH2PO40.33, HEPES 10, 葡萄糖10,用NaOH調(diào)pH至 7.4；無(wú)Ca2+臺(tái)氏液和0.2 mmol/L Ca2+的臺(tái)氏液分別為臺(tái)氏液中不加CaCl2或僅加 0.2 mmol/L CaCl2。

1.2細(xì)胞外液(mmol/L) NaCl 115, KCl 25, CaCl22, glucose 10, MgCl21, HEPES 10; 用NaOH調(diào)pH至7.4。BaCl22 mmol/L、CdCl2200 μmol/L和4-AP 4 mmol/L阻斷IK1、ICa,L和Ito電流。

1.3電極內(nèi)液 (mmol/L) K-glutamate 130, KCl 15, NaCl 5, MgCl21, HEPES 10, MgATP 5; 用NaOH調(diào)pH至7.4。

1.4細(xì)胞保護(hù)液(KB液，mmol/L) KCl 20.0，KH2PO410.0，葡萄糖10.0，谷氨酸70.0，?；撬?0.0，EGTA 10.0，牛血清白蛋白(Amerco)10 g/L,用KOH調(diào)pH至7.4。

2大鼠心房肌細(xì)胞分離

方法參照文獻(xiàn)并有所改進(jìn)[5]，健康老齡大鼠(22-24月齡)，體重(650±55)g。擊昏后迅速開(kāi)胸取出心臟，置于溫浴(37 ℃ 左右)的臺(tái)氏液中，修剪后掛于灌流裝置上，置于Langendorff 裝置上行主動(dòng)脈逆向恒流灌流。灌流步驟：(1)無(wú)鈣臺(tái)氏液灌注至心臟充分停跳，以解除心肌細(xì)胞間的橋粒和連接，使心肌松弛，約5 min。(2)膠原酶Ⅱ(0.36 g/L)和胰蛋白酶(0.1 g/L)液消化5-7 min左右；(3)剪下左右兩個(gè)心耳，剪下心房部分置于 37 ℃ 液中剪碎，加新鮮消化液消化10 min，經(jīng)150 μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾，離心后重新置于新鮮KB液中室溫保存。灌流系統(tǒng)保持37 ℃,所有液體均用100% O2飽和。分離出棒狀、橫紋清晰、細(xì)胞膜完整的單個(gè)心房肌細(xì)胞。

3膜片鉗全細(xì)胞記錄

采用全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，膜片鉗放大器(AXON-700B)與計(jì)算機(jī)連接。刺激信號(hào)及電壓輸入信號(hào)的采集均由軟件(pCLAMP 9.02)控制。玻璃毛坯(GG-17)經(jīng)微電極拉制儀(Narishige，pp-830)拉制成電阻為2.5-3.5 MΩ的電極。調(diào)節(jié)三維操縱器進(jìn)行封接，使封接電阻達(dá)1 GΩ以上，吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄模式。為消除細(xì)胞間誤差，電流值以電流密度(pA/pF)表示。信號(hào)經(jīng)截止頻率為1 kHz的四階貝塞爾低通濾波器，采樣率為5 kHz。

4誘發(fā)If電流刺激參數(shù)的設(shè)定

4.1If電流的記錄 保持電位-40 mV，施予4 000 ms，-150 mV的去極化脈沖，可引出超極化激活的內(nèi)向電流。

4.2If電流I-V曲線 保持電位-40 mV，施予4 000 ms，階躍10 mV，-150～-50 mV系列脈沖刺激，將各電壓下的電流和尾電流密度對(duì)相應(yīng)刺激電位作圖。

4.3If電流穩(wěn)態(tài)激活過(guò)程 按I-V曲線刺激模式，獲得各電壓下電流，換算為電導(dǎo)，以各去極化電位下電導(dǎo)與最大電導(dǎo)的相對(duì)值對(duì)脈沖電壓作圖，得If的激活曲線。依Bolzmann方程I/Imax=1/{1+exp[-(Vm-V1/2) /k]}求出半穩(wěn)態(tài)激活電壓(V1/2)和穩(wěn)態(tài)激活曲線斜率(k)。

4.4If電流的翻轉(zhuǎn)電位 保持電位-40 mV，施予2 000 ms，-150 mV的去極化脈沖，緊接著給予-100 mV至+40 mV的系列刺激，記錄電流的改變，觀察電流的翻轉(zhuǎn)電位。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1老齡大鼠心房肌細(xì)胞If電流密度的特征

約85%(17/20個(gè)細(xì)胞)的老齡大鼠心房肌細(xì)胞可記錄到超極化激活I(lǐng)f，在-150 mV時(shí)，If的電流幅值約為(392±23)pA，其電流密度約為(3.2±0.4)pA/pF[其電容約為(122.0±8.3)pF]。而青年大鼠只有40%(8/20個(gè)細(xì)胞)的心房肌細(xì)胞記錄到If，在-150 mV時(shí)電流幅值約為(86.9±8.4)pA，電流密度約為(0.9±0.1)pA/pF[其電容約為(92.1±7.5)pF]，二者比較有顯著差異(n=20,P<0.01)，該電流對(duì)CsCl敏感，2 mmol/L CsCl幾乎可以將其完全阻斷，見(jiàn)圖1。

Figure 1. At the test potential of-150 mV,Ifdensities markedly increased in aged rats.

圖1老齡大鼠心房肌細(xì)胞If電流的記錄

2老齡大鼠心房肌細(xì)胞IfI-V曲線的特征

從I-V曲線可以看出，隨著電位向超極化方向移動(dòng)，老齡組細(xì)胞電流迅速增加，而青年組細(xì)胞電流雖有增加，但增加的幅度較小，見(jiàn)圖2。

圖2老齡大鼠心房肌細(xì)胞If電流的I-V曲線

3老齡大鼠心房肌細(xì)胞If穩(wěn)態(tài)激活的特征

在青年對(duì)照細(xì)胞上If的半激活電壓(V1/2)為(-104.4±6.3)mV，而老齡組細(xì)胞電流的半激活電壓為(-87.2±2.3)mV，明顯移向靜息電位，見(jiàn)圖3。同時(shí)，激活動(dòng)力學(xué)研究顯示，在老齡大鼠的心房肌細(xì)胞上電流的激活時(shí)間常數(shù)(τ)為(230.2±14.4)ms，而青年對(duì)照組心房肌細(xì)胞的τ則為(670.5±23.6)ms，前者顯著快于后者(P<0.01)。

圖3老齡大鼠心房肌細(xì)胞If電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線

4老齡大鼠心房肌細(xì)胞If的翻轉(zhuǎn)電位

無(wú)論是青年對(duì)照組或是老齡組，大鼠細(xì)胞的翻轉(zhuǎn)電位相近，老齡組細(xì)胞為(-77.3±6.8)mV，而青年對(duì)照組細(xì)胞(-80.7±5.4)mV，2組比較無(wú)顯著差異。

5老齡大鼠心房肌細(xì)胞If電流對(duì)ISO的反應(yīng)

在細(xì)胞外應(yīng)用1 μmol/L ISO后，老齡大鼠心房肌細(xì)胞If電流密度從(3.2±0.4)pA/pF升至(7.3±0.5)pA/pF(P<0.01，n=19)，而青年組心房肌細(xì)胞給藥后從電流密度(0.9±0.1)pA/pF升至(2.3±0.2)pA/pF(P<0.01，n=19)，可見(jiàn)ISO使老齡大鼠的電流升高約為2.3倍，而青年大鼠的電流升高約為2.6倍，二者升高幅度相近。

討 論

起搏電流(If)是一種超極化激活的電流, 其通道在-50 mV 水平開(kāi)始開(kāi)放，到-120 mV充分開(kāi)放。其主要成份是Na+和K+，尤其是Na+的內(nèi)流。它是竇房結(jié)細(xì)胞的主要離子流，其活動(dòng)增加，自律性增強(qiáng)。老年人由于心臟組織結(jié)構(gòu)和神經(jīng)支配改變，特別是竇房結(jié)的退行性變，竇房結(jié)細(xì)胞減少甚至消失，使得竇性心律降低，而潛在起搏點(diǎn)如心房肌細(xì)胞起搏電流活動(dòng)增強(qiáng)，將為異位起搏發(fā)生提供條件，起搏電流在異位節(jié)律增高方面均起著關(guān)鍵性作用[6,7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，老齡大鼠心房肌細(xì)胞起搏電流的密度和激活均高于青年鼠，且可記錄到電流的細(xì)胞數(shù)也明顯增加，提示這可能是老齡大鼠心房容易出現(xiàn)異位起搏和誘發(fā)的離子基礎(chǔ)。進(jìn)一步，對(duì)通道門控特征的研究發(fā)現(xiàn)，老齡大鼠心房肌細(xì)胞隨著超極化電位的增加，半激活電壓向更正的電位方向移動(dòng)，即移向更接近靜息電位。因此，我們推測(cè)老齡大鼠心房肌細(xì)胞起搏電流的增加與通道激活過(guò)程和激活電位改變又密切關(guān)系。起搏電流可以被β受體所調(diào)控[8,9]，結(jié)果顯示，β受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素均可使2組的電流增加，但增加幅度在老年組和青年組無(wú)較大差異，提示2種細(xì)胞上起搏通道電流對(duì)異丙腎上腺素反應(yīng)的敏感性基本一致。本文結(jié)果顯示對(duì)于老年人房顫應(yīng)注意異位起搏點(diǎn)的發(fā)生，更應(yīng)重視起搏電流在其中所起的作用。

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Characteristicsofpacemakercurrentinagedratatrialmyocytes

LIN Kun1, LAN Yun-feng2, FANG Zhou2, GAO Jin-liao2, WANG Hong-juan2, LI Yang2

(1DepartmentofCardiology,2InstituteofGeriatricCardiology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China.E-mail:liyangbsh@163.com)

AIM: To investigate the characteristics of pacemker current (If) of atrium myocytes in aged rats.METHODSAged SD rats (22-24 months) were used in the study. The single atrium myocytes were isolated.Ifcurrent was recorded by the technique of whole-cell patch clamp.RESULTSThe densities ofIfincreased markedly in aged rat atrium myocytes compared with that in the cells of young rats. At the test potential of-150 mV, the average amplitude ofIfwas (382±23)pA and the current density was (3.2±0.4)pA/pF, while the average amplitude ofIfin control group was (86.9±8.4)pA and the current density was (0.9±0.1)pA/pF,P<0.01.Ifcurrent was augmented at negative hyperpolarzing test potential. Time constants of activation in aged and control cells were (230.2±14.4)ms and (670.5±23.6)ms, respectively. Furthermore, steady state curves in the elder cells was shifted to positive potentials and the voltages for half maximal activation were (-87.2±2.3)mV (aged cells) and (-104.4±6.3)mV (control cells). In contrast, the slope of activation curves and reversed potential ofIfwere slightly different between aged cells and control cells.CONCLUSIONThe amplitude and densities ofIfin atrium cells of aged rats were larger than that of control rats.

Aged rats; Atrium myocytes; Pacemaker current

R965; R972.2; Q424

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.009

1000-4718(2011)01-0048-04

2010-06-24

2010-10-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30570739)

△通訊作者 Tel：010-66936762； E-mail: liyangbsh@163.com