劉亦敏，聶金泉，趙玉龍，彭年才

(西安交通大學(xué)機(jī)械制造系統(tǒng)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710049)

PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)［1］，是指在DNA聚合酶催化下，以單鏈DNA為模板，特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性(90℃ ～95℃)、退火(50℃ ～65℃)、延伸(70℃ ～75℃)等步驟，體外復(fù)制出與單鏈DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程，是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，用于快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。PCR擴(kuò)增技術(shù)問世不久，便以其簡(jiǎn)便、快速、高效等特點(diǎn)迅速成為分子生物學(xué)研究的基本技術(shù)和有力工具，并成為DNA實(shí)驗(yàn)室不可缺少的組成部分。傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)容器與加熱器是分離的，體積較大，操作不方便，分析時(shí)間長(zhǎng)而且所耗費(fèi)樣品量也較大，已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代生物化學(xué)研究的需要，大大限制了它的應(yīng)用。

MEMS(Micro Electronic Mechanical System—微機(jī)械電子系統(tǒng))是近幾十年發(fā)展起來的，可以用微電子等批量加工工藝制造的集微執(zhí)行器、微傳感器、集成電路等部件于一體的機(jī)電系統(tǒng)。PCR微型生物檢測(cè)芯片將MEMS技術(shù)和PCR擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，體積小，對(duì)樣品量的需求非常少，分析時(shí)間短，能夠在10 s內(nèi)完成一次PCR循環(huán)，并且在370 s內(nèi)完成整個(gè)過程［2］。具有微型化，集成化，便攜化的優(yōu)勢(shì)，可以廣泛用于醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、商品檢驗(yàn)、環(huán)境檢測(cè)、刑事、軍事及航空航天等科學(xué)領(lǐng)域。目前，針對(duì)PCR芯片的研究主要分為動(dòng)態(tài)連續(xù)流式PCR微流控芯片［3］和靜態(tài)微腔式 PCR 芯片［4］兩類。

國外對(duì)于PCR芯片的研究相對(duì)較多，而國內(nèi)的研究機(jī)構(gòu)僅有少數(shù)幾家。德國高技術(shù)物理研究所的Poser等人［5］最早詳細(xì)地討論了微腔式PCR芯片上的熱傳導(dǎo)和溫度分布問題。他們利用有限元方法研究芯片反應(yīng)腔內(nèi)的溫度分布情況以及溫度轉(zhuǎn)換時(shí)熱傳導(dǎo)的瞬時(shí)變化，并制作了三種PCR芯片加以驗(yàn)證。美國加州大學(xué)伯克利分校的Lagally等人和Lawrence Livermore國家實(shí)驗(yàn)室的Northrup等人［6］將電阻加熱器和風(fēng)扇空氣制冷配合使用進(jìn)行溫度控制。中科院電子所的趙燕青和崔大付［7］等人利用薄膜技術(shù)與MEMS技術(shù)，將熱電材料依照帕爾帖模型排列組合制作于PCR芯片的反應(yīng)腔底部，實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)腔升降溫的操作，并通過改變電流方向，實(shí)現(xiàn)兩者的切換。

本文提出的新型PCR集成芯片以MEMS技術(shù)為基礎(chǔ)，集反應(yīng)腔、加熱器和測(cè)溫單元于一體。在一個(gè)芯片系統(tǒng)上集成了多個(gè)具有獨(dú)立加熱和測(cè)溫功能的PCR陣列單元，可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行分析;采用了摻雜半導(dǎo)體作為加熱電阻來提高加熱效率，改善反應(yīng)腔內(nèi)的溫度均勻性，降低系統(tǒng)功耗。文中介紹了PCR芯片的總體設(shè)計(jì)、理論分析、仿真、版圖制作及加工工藝方案，設(shè)計(jì)制作了體積小、反應(yīng)速度快、操作簡(jiǎn)便、加熱效率高、節(jié)省成本和高度集成化的PCR微反應(yīng)腔芯片系統(tǒng)，在生化檢測(cè)領(lǐng)域具有重要意義和廣闊的發(fā)展前景。

1 芯片的設(shè)計(jì)

微反應(yīng)腔用于為核酸擴(kuò)增提供所需的溫度環(huán)境，保證擴(kuò)增過程的高效完成。本文介紹的PCR集成微反應(yīng)腔芯片采用直徑為4″厚度為400 μm的(100)晶面雙拋硅片，在上面集成了四個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)腔單元，成對(duì)稱排列分布，微加熱器和微傳感器集成在硅片背面，反應(yīng)單元結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 PCR芯片結(jié)構(gòu)示意圖

反應(yīng)腔深度越深，芯片的升溫速率越快，但是芯片的總體結(jié)構(gòu)強(qiáng)度也將降低，因而在硅基厚度一定的情況下，腔體的刻蝕深度不宜過大。所以采用較小的反應(yīng)腔容積來實(shí)現(xiàn)芯片的微型化和試劑的微量化。加工后單個(gè)芯片的尺寸為12 000 μm×12 000 μm×400 μm，包含2×2個(gè)對(duì)稱排列的正方形微反應(yīng)腔，每個(gè)反應(yīng)腔的上表面尺寸為2 500 μm×2 500 μm，刻蝕深度為350 μm，反應(yīng)腔容積約為1.78 μL。

加熱器的電阻采用半導(dǎo)體摻雜工藝制作，摻雜電阻位于硅基材料內(nèi)部，電阻分布越均勻，試劑的溫度均勻性就越好，例如蛇形分布、W形分布。但是為了減小加熱電阻對(duì)測(cè)溫過程的干擾，確保測(cè)溫的準(zhǔn)確性，必須給測(cè)溫電阻留出足夠的空間［8］。綜合以上兩種考慮，本文采用兩側(cè)分布的加熱電阻實(shí)現(xiàn)方式，并且使用了多電阻條加熱方式來盡可能的增大芯片的受熱面積，避免集中加熱導(dǎo)致的溫度變化的不均勻，下圖2所示即為設(shè)計(jì)的半導(dǎo)體加熱器和Pt溫度傳感器的分布方式。圖中的加熱器電阻采用串并聯(lián)加熱電路，每根加熱電阻條尺寸為1 900 μm×20 μm，左右各12根對(duì)稱分布，每邊各有6根加熱子位于反應(yīng)腔底部的內(nèi)側(cè)，另外6根位于反應(yīng)腔底部的外側(cè)，相鄰兩根加熱子之間的距離為25 μm，半導(dǎo)體電阻阻值約為20Ω/□，單個(gè)加熱裝置的阻值約為320 Ω。這種加熱器之間的間距較大，充分考慮了加熱器對(duì)溫度傳感器的影響和反應(yīng)腔各向異性腐蝕時(shí)所留下的坡度問題，有利于PCR擴(kuò)增時(shí)的溫度均勻性和加熱效率的提高。

圖2 半導(dǎo)體加熱器和Pt溫度傳感器的分布方式

溫度傳感器采用金屬Pt淀積制作的薄層電阻［9］作為敏感元件［10-12］。Pt電阻位于反應(yīng)腔底部中央，與微加熱器保持一定的距離，減小加熱器對(duì)測(cè)溫過程的干擾。同時(shí)，設(shè)計(jì)了較長(zhǎng)的Pt電阻來提高測(cè)溫靈敏度，厚度為1 000 ?～2 000?，寬度為20 μm，長(zhǎng)度為5.5 mm，結(jié)構(gòu)為弓字形，分布方式如上圖2所示。

芯片在設(shè)計(jì)時(shí)的特點(diǎn):在一個(gè)芯片系統(tǒng)上集成了多個(gè)PCR陣列單元，且每個(gè)單元都有獨(dú)立的加熱和測(cè)溫單元，可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行分析，使得PCR芯片系統(tǒng)具有高效、可靠的工作性能;在設(shè)計(jì)微加熱器時(shí)，沒有采用大片的注入摻雜半導(dǎo)體的方式，而是將摻雜電阻設(shè)計(jì)成并行排列的有一定間隔的多條狀方式，布置于反應(yīng)腔底部的兩側(cè)，加大芯片受熱面積，改善溫度均勻性，減小超調(diào)量，降低系統(tǒng)功耗，從而實(shí)現(xiàn)了良好的溫控性能。

2 熱性能分析及仿真

2.1 集總參數(shù)法與數(shù)值模擬

微腔型PCR芯片熱循環(huán)的基本原理是通過對(duì)芯片和反應(yīng)液整體加熱和冷卻來實(shí)現(xiàn)熱循環(huán)的升降溫與恒溫過程的。在計(jì)算和仿真的過程中，認(rèn)為芯片的換熱表面始終為其上表面，加熱過程芯片與空氣自然對(duì)流換熱，冷卻過程采用強(qiáng)制對(duì)流換熱，分析邊界條件為:空氣自然對(duì)流換熱系數(shù)h1=10 W/(m2·K);空氣強(qiáng)迫對(duì)流換熱系數(shù)h2=100 W/(m2·K);外部空氣環(huán)境溫度Tf=26℃。由于芯片厚度很小，忽略芯片側(cè)面和底面的散熱，忽略熱輻射、熱相變及界面熱阻。

由于微器件的特征尺度大多在毫米甚至微米量級(jí)，其畢渥數(shù)Bi遠(yuǎn)小于1，物體內(nèi)部的導(dǎo)熱熱阻遠(yuǎn)小于其表面的換熱熱阻，可以認(rèn)為整個(gè)物體在同一瞬間溫度趨于一致，與空間坐標(biāo)無關(guān)。該物體原來連續(xù)分布的質(zhì)量和熱容量都匯總在一點(diǎn)上，這種忽略物體內(nèi)部導(dǎo)熱熱阻的研究方法稱為集總參數(shù)法［13］，也就是將整個(gè)系統(tǒng)簡(jiǎn)化為一個(gè)忽略內(nèi)部導(dǎo)熱熱阻的節(jié)點(diǎn)。

本文使用上述集總參數(shù)法分析整個(gè)芯片在加熱和冷卻過程中的速率和功率。在集總參數(shù)法的基礎(chǔ)上，建立了如下圖3所示的數(shù)學(xué)模型。在該模型中，對(duì)芯片內(nèi)溫度分布進(jìn)行分析時(shí)，將芯片拆分為多體系節(jié)點(diǎn)結(jié)構(gòu)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)相當(dāng)于集總參數(shù)法的集總節(jié)點(diǎn)。將物理模型拆分為三個(gè)節(jié)點(diǎn):玻片節(jié)點(diǎn)、反應(yīng)液節(jié)點(diǎn)和硅基襯底材料節(jié)點(diǎn)，這種模型用來分析熱循環(huán)過程中不同單元的熱特性。

圖3 多體系節(jié)點(diǎn)模型

在上述模型中，硅基、反應(yīng)液、玻璃片的熱容分別為C1、C2、C3，節(jié)點(diǎn)總熱容為C;節(jié)點(diǎn)溫度為T，加熱功率為Q;空氣溫度為Tf，空氣對(duì)流換熱系數(shù)為h。根據(jù)能量守恒定律，單位時(shí)間內(nèi)吸收的熱量，等于其熱力學(xué)能的變化。依此定律建立集總參數(shù)法控制方程如下:

引入過余溫度:

代入式(1)并分離變量得:

對(duì)等式(3)兩端積分可得:

加熱過程中，θ0=T0-Tf，芯片起始溫度T0等于環(huán)境溫度Tf時(shí)，θ0=0;在PCR擴(kuò)增熱循環(huán)過程中，T0可能是退火溫度55℃或者延伸溫度72℃。

冷卻過程中，輸入功率Q=0，降溫起始溫度為變性溫度96℃，式(4)可以同時(shí)分析芯片的升降溫過程。

保溫過程中，溫度變化率為0，式(1)的左邊項(xiàng)為0，則穩(wěn)態(tài)情況下為保持溫度T所需提供的功率為:

根據(jù)集總參數(shù)法計(jì)算，將芯片各項(xiàng)參數(shù)代入式(1)中，可得芯片熱循環(huán)時(shí)升降溫速率與溫度關(guān)系。

升溫速率:

降溫速率:

式中:Q為加熱器功率，W;T為芯片溫度，℃。

下圖4為升溫過程中輸入功率分別為0.1 W～0.8 W時(shí)升溫速率與溫度關(guān)系圖，下圖5為降溫過程中輸入功率為0時(shí)降溫速率與溫度關(guān)系圖。

圖4 升溫速率-溫度關(guān)系圖

由圖4可知，在加熱過程中，加熱功率越大，升溫速率越快，同時(shí)，隨著溫度的升高，升溫速率會(huì)有所下降。功率在0.4 W～0.8 W的范圍內(nèi)時(shí)，升溫速率可以達(dá)到2℃/s～5℃/s，能夠滿足PCR反應(yīng)的要求。

由圖5可知，芯片冷卻過程中通過空氣強(qiáng)制對(duì)流換熱，冷卻速率是不一致的，芯片溫度越高，冷卻速率越大，冷卻速率可以保持在2.8℃/s～6.7℃/s范圍內(nèi)。

圖5 冷卻速率-溫度關(guān)系圖

通過式(4)計(jì)算可得加熱和冷卻過程的溫度-時(shí)間關(guān)系如下，設(shè)起始溫度都為T0。

加熱過程溫度-時(shí)間關(guān)系式:

冷卻過程溫度-時(shí)間關(guān)系式:

采用上述集總參數(shù)法計(jì)算微腔型PCR集成芯片在0.05 W至0.8 W的不同功率下升溫與降溫的速率，并與ANSYS有限元數(shù)值模擬的結(jié)果相比較，所得結(jié)果如圖6、圖7所示。

圖6 集總參數(shù)法與數(shù)值模擬在升溫過程中的比較

圖7 集總參數(shù)法與數(shù)值模擬在冷卻過程中的比較

由圖6、圖7可知，所建立的PCR芯片的集總參數(shù)模型能夠準(zhǔn)確地刻畫芯片的升降溫過程。熱輸入功率小于0.4 W時(shí)，加熱過程的溫升速率較小。

2.2 PCR擴(kuò)增過程熱動(dòng)態(tài)仿真

標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程由變性、退火、延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。在對(duì)芯片的熱循環(huán)過程仿真時(shí)以退火55 ℃(328.15 K)、延伸72 ℃(345.15 K)、變性96 ℃(369.15 K)為恒溫設(shè)定值，三個(gè)恒溫階段對(duì)應(yīng)的時(shí)間分別為:45 s、60 s、30 s。加熱階段的熱輸入功率設(shè)為0.4 W，恒溫階段的的熱輸入功率以及時(shí)間節(jié)點(diǎn)通過上述集總參數(shù)法計(jì)算獲得，各項(xiàng)參數(shù)見表1所示。

表1 PCR擴(kuò)增過程功率、時(shí)間參數(shù)

整個(gè)動(dòng)態(tài)仿真過程通過多載荷步、多載荷文件的方式進(jìn)行連續(xù)求解，對(duì)芯片在一個(gè)完整PCR擴(kuò)增過程中的溫度分布進(jìn)行觀察。在恒溫控制階段，芯片的整體溫差非常小，仿真結(jié)果可以達(dá)到0.5℃以內(nèi)。對(duì)PCR芯片底部反應(yīng)腔中間位置進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取，獲得溫度-時(shí)間變化曲線，如圖8所示，該位置的溫度數(shù)據(jù)即為溫度傳感器將要采集的溫度數(shù)據(jù)。

圖8 PCR擴(kuò)增過程動(dòng)態(tài)仿真溫度-時(shí)間曲線

從圖8中可以看到，72℃加熱到96℃與96℃保溫兩個(gè)階段的仿真效果較好，和計(jì)算的結(jié)果一致;55℃保溫階段與計(jì)算有大約2%的偏差;72℃保溫階段與計(jì)算有大約1%的偏差，超出單載荷工況下的計(jì)算和仿真誤差，這應(yīng)該是由于開環(huán)控制時(shí)產(chǎn)生的誤差通過積累后導(dǎo)致的。為了獲得較好的PCR熱循環(huán)仿真曲線，對(duì)時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行修訂，恒溫退火(55℃)階段的起始時(shí)間節(jié)點(diǎn)修訂為53.13 s，獲得的結(jié)果如圖9所示。

圖9 修訂后PCR擴(kuò)增過程動(dòng)態(tài)仿真溫度-時(shí)間曲線

修訂后的功率、時(shí)間參數(shù)能很好的實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR擴(kuò)增全過程的模擬仿真。其中，加熱冷卻過程時(shí)間很短，恒溫階段的溫度變化非常小，能夠滿足PCR反應(yīng)的要求。對(duì)整個(gè)動(dòng)態(tài)過程的模擬仿真說明了本文對(duì)PCR芯片的熱分析和參數(shù)計(jì)算是精確的，通過本文分析計(jì)算獲得的各項(xiàng)公式和參數(shù)對(duì)PCR芯片實(shí)際應(yīng)用有很大的參考和應(yīng)用價(jià)值。

本文在計(jì)算分析和仿真時(shí)的特點(diǎn):使用集總參數(shù)法對(duì)芯片的熱力學(xué)特性進(jìn)行研究;提出了一種多體系分層模型并采用其算法對(duì)芯片和反應(yīng)液的溫度差進(jìn)行計(jì)算分析;提出了一種更加接近于實(shí)際PCR芯片結(jié)構(gòu)的多體系節(jié)點(diǎn)模型。

3 芯片的制作工藝

綜合考慮器件性能及國內(nèi)現(xiàn)有的工藝條件，PCR集成芯片采用了體硅微加工工藝，根據(jù)生物芯片的加工要求，研究了適合PCR集成芯片系統(tǒng)的制造工藝，保證各種相關(guān)工藝的兼容性和完整性。整個(gè)工藝流程共用6塊掩膜版［14］，版圖如圖10所示。

圖10 集成PCR芯片的工藝版圖

芯片的主要加工流程如下:(1)清洗硅片;(2)在硅片表面硼離子注入至所需濃度，形成P-區(qū);(3)在引線區(qū)硼離子注入，形成P+區(qū);(4)使用低壓化學(xué)氣相沉積(LPCVD)淀積一層SiO2和Si3N4，形成KOH腐蝕的掩膜層;(5)正面光刻，刻蝕第一層SiO2和Si3N4，形成Pt電阻濺射的掩膜層;(6)濺射金屬，正面光刻，形成Pt電阻;(7)正面光刻，刻蝕形成鋁引線與電阻之間的引線孔;(8)濺射金屬，正面光刻，形成鋁引線;(9)背面KOH溶液各向異性腐蝕，形成芯片微腔體;(10)等離子增強(qiáng)化學(xué)汽相淀積(PECVD)制作二氧化硅鈍化層。

圖11即為本文設(shè)計(jì)制作的微腔型PCR集成芯片的實(shí)物照片。

圖11 微腔型PCR集成芯片的實(shí)物照片

4 結(jié)論

本文主要開展新型PCR集成芯片的設(shè)計(jì)，針對(duì)PCR芯片集成化、微量化、快速化的要求，以MEMS技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合溫度傳感器和嵌入式半導(dǎo)體加熱器的特點(diǎn)，研制了一種可實(shí)現(xiàn)微量、高效快速、一次性檢測(cè)的微反應(yīng)腔型PCR集成芯片。并在此基礎(chǔ)上，重點(diǎn)研究了PCR集成芯片的設(shè)計(jì)、制作、計(jì)算分析的相關(guān)技術(shù)問題，仿真分析了芯片的熱力學(xué)特性，獲得了優(yōu)化的微加熱器設(shè)計(jì)和合適的加熱功率。熱分析結(jié)果表明，在較大的加熱冷卻速率下，芯片的溫度不均勻性仍然很小，這是加熱器形狀和尺寸不斷改進(jìn)優(yōu)化的結(jié)果，也充分體現(xiàn)了微結(jié)構(gòu)PCR集成芯片的優(yōu)越性。最后利用體硅微加工工藝為這種新結(jié)構(gòu)的生物芯片設(shè)計(jì)了整套的加工流程和版圖，對(duì)以后的加工和測(cè)試具有很好的參考價(jià)值。

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