劉峰，張曉波，任紅波，金海濤，馬文瓊，孟利

（1.黑龍江省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品質量安全研究所，農(nóng)業(yè)部谷物及制品質量監(jiān)督檢驗測試中心，哈爾濱150086；2.黑龍江大學生命學院，哈爾濱150080）

梯度淋洗/離子色譜法測定嬰兒乳粉中硝酸鹽

劉峰1，張曉波1，任紅波1，金海濤1，馬文瓊1，孟利2

（1.黑龍江省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品質量安全研究所，農(nóng)業(yè)部谷物及制品質量監(jiān)督檢驗測試中心，哈爾濱150086；2.黑龍江大學生命學院，哈爾濱150080）

嬰兒乳粉中含有豐富的營養(yǎng)物質，存在干擾硝酸鹽分析的未知成分。采用梯度淋洗方式將其與硝酸鹽進行分離，達到了準確測定的目的。分析過程中采用乙酸溶液沉淀乳乳粉中蛋白，過濾后用RP柱去除樣品中的脂類物質。凈化后，直接將試樣注入離子色譜儀分析，淋洗液由自動發(fā)生器產(chǎn)生，外標法定量。穩(wěn)定性實驗5次進樣硝酸鹽的峰面積平均值為0.2961 μS·min（RSD為0.35%），保留時間平均值為26.721 min（RSD為0.23%）。組分添加回收率分別為99.04%和99.43%，相對偏差（RSD）分別為1.85%和1.02%。

嬰兒乳粉；硝酸鹽；梯度淋洗；離子色譜

0 引言

硝酸鹽和亞硝酸鹽廣泛存在于自然環(huán)境中，硝酸鹽往往表現(xiàn)為亞硝酸鹽的毒性。亞硝酸鹽與亞硝胺的形成有關，動物試驗中被證實為致癌物。嬰兒乳粉中的營養(yǎng)成分不同于普通乳粉，其中加入了豐富的營養(yǎng)物質，這些營養(yǎng)物質經(jīng)常對分析造成干擾。采用等度離子色譜法測定嬰兒乳粉中的硝酸鹽解決不了乳粉中存在干擾的問題，將影響硝酸鹽分析的干擾物質有效分離，不能準確測定，也可能造成假陽性判定。分析采用EG40發(fā)生器自動生成KOH梯度淋洗液，淋洗過程中先采用較低濃度的淋洗液進行淋洗，將嬰兒乳粉中的干擾物質與硝酸鹽分離，然后采用較高濃度淋洗液凈化分析系統(tǒng)。方法簡單、易行，且靈敏度、準確度高，重現(xiàn)性好，能夠滿足實際樣品的測定需要[1-2]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICS-3000離子色譜儀，色譜工作站為Chromeleon 6.80中文版，配有RFIC-30淋洗液自動發(fā)生裝置。所用陰離子標準儲備液(質量濃度1 000 mg/L)采用優(yōu)級純配制。所有用水均為電阻率18.3 MΩ的去離子水。

在啟動儀器后，平衡時間一般不少于15 min。為獲得良好的基線，可以先用較高的濃度較高OH-淋洗液（濃度為30～50 mmol/L）進行淋洗，然后再通過較低濃度的OH-淋洗液（濃度為5～10 mmol/L）平衡系統(tǒng)。抑制器為連續(xù)自動再生膜陰離子抑制器，儀器工作條件如表1所示。

表1 儀器主要工作條件

1.2 標準溶液的配制

硝酸鈉于101～103℃烘箱內烘干2 h，在保干器內冷卻至室溫。準確稱取干燥后的硝酸鈉0.068 5 g于燒杯中，加少量水溶解。滴加10滴氫氧化鉀溶液（濃度為1.0 mol/L）后轉移定容于50 mL容量瓶內，混勻。該標準溶液于4℃保存，有效期為3個月。此溶液中硝酸鹽的質量濃度為1 000 mg/L。標準工作溶液用去離子水依次逐級稀釋，低于質量濃度100 mg/L的標準溶液需要當天配制。硝酸鹽標準中間液：20.0 g/L，硝酸鹽標準工作液為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mg/L；該標準溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，硝酸鈉（NaNO3，純度＞99.5%）[3]。

圖1 標樣的NO3-色譜

1.3 優(yōu)化梯度淋洗液條件

采用EG40發(fā)生器自動發(fā)生成OH淋洗液，自動發(fā)生器可在線產(chǎn)生無游離碳酸的淋洗液，泵在整個過程中只輸送去離子水，淋洗液的濃度是由電流和流速控制的，使梯度混合的精確度提高，去除了機械混合中易造成的誤差。淋洗液為氫氧化鉀溶液，濃度為4.0～60 mmol/L。洗脫梯度為4 mmol/L淋洗33 min，60 mmol/L淋洗8 min,4 mmol/L淋洗5 min，如表2所示。

1.4 RP柱的活化

在使用Dionex OnGuard RP柱前，需按以下步驟對其進行活化后方可處理樣品：用5 mL甲醇活化Dionex OnGuard RP小柱，推動速度每分鐘不超過3 mL；用10 mL去離子水沖洗RP小柱，推動速度每分鐘不超過3 mL；將小柱平放20 min；將5 mL樣品緩慢推入小柱，推動速度每分鐘不超過3 mL，棄去前3 mL。收集2 mL樣品，稀釋進樣或直接進樣。Dionex OnGuard RP小柱可反復使用，每次使用前按照上述步驟重新活化即可，活化時可以通過固相萃取裝置進行，施加正壓和負壓均可，但在處理過程中不可使RP柱的填料暴露于空氣中。如重新活化后，柱填料顏色不褪去，則應改換小柱。

1.5 樣品的處理與樣品的凈化

稱取1.0g嬰兒乳粉樣品，將其置于100 mL容量瓶中，加入約80 mL去離子水，搖勻。用超聲波超聲提取30 min，加入3.0%冰乙酸水溶液2 mL，定容，放入4℃冰箱中冷卻20 min。過濾時將上層清液倒入濾紙過濾，盡量減少搖動，避免下層沉淀的蛋白質進入濾紙中，濾液備用。樣品過濾凈化時，取過濾液15 mL通過0.22 μm水性濾膜針頭濾器、RP柱，棄去前面3 mL收集后面洗脫液待測。

2 結果與討論

2.1 提取及分離條件的選擇

表2 梯度淋洗液條件

嬰兒乳粉中含有豐富的蛋白質，測定前必須將其去除，否則會造成色譜柱污染。方法包括以下幾種：乙腈去除法、沉淀劑去除法，而使用的沉淀劑又為乙酸鋅加亞鐵氰化鉀和冰乙酸兩種。使用乙腈去除蛋白時，如果取樣品4 mL則加入5 mL乙腈，加入的乙腈會起到很好的去除蛋白的效果。但是抑制器需要使用外加水模式，在這種模式下外加水依靠外加氮氣將其壓出，氣壓控制需要比較精確，實際操作比較困難。而采用乙酸鋅加亞鐵氰化鉀除蛋白法則是分別加入約20%的乙酸鋅和10%的亞鐵氰化鉀，兩種沉淀劑在電導檢測器都會有很高的電導值相應，影響電導檢測器的使用壽命。加入冰乙酸產(chǎn)生的電導值較低，去除蛋白效果好，因此本試驗選用冰乙酸作為除蛋白的沉淀劑[4]。

分離過程中的流動相采用EG發(fā)生器自動生成OH淋洗液，如OH的濃度高，硝酸鹽的出峰時間提前，反之則延后。如選取OH為4 mmol/L，則出峰時間約26 min，取OH為6 mmol/L，出峰時間約22 min，OH為8 mmol/L，出峰時間約18 min，選擇更高的OH會造成EG中KOH的浪費。嬰兒乳粉中的有機酸類豐富，選擇高濃度的OH可減少分析時間，但是選擇過高的OH-淋洗液可能存在有機酸干擾，造成分離硝酸鹽和有機酸不能完全分離，影響結果的判定[5]。

2.2 儀器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

取嬰兒乳粉樣品1份，添加濃度為2.0 mg/L的硝酸鹽，然后按樣品分析方法處理，每隔2 h進行一次分析。0～8 h內共進行進樣分析5次，硝酸鹽峰面積的平均值為0.2961μS·min（RSD為0.35%），保留時間平均值為26.721min（RSD為0.23%），結果表明樣品經(jīng)處理后8h內進樣對樣品測定結果無明顯影響。

2.3 線性范圍、回歸方程和檢出限

用硝酸鹽標準中間液配制標準工作液，質量濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mg/L，分別對5個質量濃度的標準系列工作液進樣，峰面積（Y）與溶液質量濃度（X）進行線性回歸分析，標準曲線的回歸方程為Y=1.0115 X-0.081，R2=0.9997。表3為標準樣品分析結果。由表3，根據(jù)信噪比S/N=5，測得硝酸鹽的檢出限為0.8 mg/kg。

表3 標準樣品分析結果

2.4 樣品測定及回收率試驗

稱取乳粉樣品1.0和2.0 g，加入10 mL去離子水，然后按照1.5節(jié)的處理方法，測定結果見表4，并同時進行回收試驗，分別加入1.0和2.0 mg/kg硝酸鹽標樣，組分的平均回收率分別為99.04%和99.43%，RSD分別為1.85%和1.02%（n=5）。

表4 樣品分析結果

3 討論

離子色譜法分析陰離子的過程中采用的檢測器為電導檢測器，其對一切產(chǎn)生電導的物質都會有響應。而分析嬰兒乳粉的過程中，由于乳粉中含有大量的營養(yǎng)成分，有可能存在干擾離子（有機酸等），其出峰時間與可能硝酸鹽接近，國家標準測定方法中，淋洗液洗脫濃度較高，不能徹底排除干擾，可能造成假陽性誤判。優(yōu)化淋洗液中的KOH濃度并采用梯度洗脫的方式，使干擾離子與硝酸鹽分離度增加，解決了干擾物質影響分析的問題。實現(xiàn)了等度淋洗離子色譜法不能準確測定嬰兒乳粉中硝酸鹽的問題，提高了靈敏度、分辨率和重現(xiàn)性，達到了快速測定嬰兒乳粉中硝酸鹽的目的。

[1] 牟世芬,劉克納.離子色譜方法及應用[M]北京:化學工業(yè)出版社,2000.64-80.

[2] 孫明山,孫忠萍,牛朝紅，等.離子色譜法對生活飲用水中氟、氯、硫酸根、硝酸根陰離子的測定[J].農(nóng)業(yè)與技術，2007,4(2).:89-90.

[3] 顧文奎,劉肖.離子色譜法檢測污水樣品中無機陰離子[J].口岸衛(wèi)生控制，2007,12(3):24-26.

[4] 劉峰,金海濤.離子色譜法同時測定飲用水中7種陰離子的研究[J].哈爾濱商業(yè)大學學報，2008(5):103-106.

[5] MURAD IHH,TAKASHIK.Ion Chromatogram Method for Nitrate and Nitrite in Human Saliva[J].JournalChromatogram，2000,744(2):433-437.

Determination of nitrate in infant milk powder using gradient elution/Ion chromatography

LIU Feng1,ZHANG Xiao-bo1,REN Hong-bo1,JIN Hai-tao1,MA Wen-qiong1MENG Li2
(1.Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Institute for quality and safety of agricultural products，Ministry of A-griculture Grain and its Products Quality Supervision and Testing Center,Harbin 150086,China；2.College of Life Science,Heilongjiang University,Harbin 150080,China)

Infant milk powder is very rich in nutrients,there is interference with nitrate analysis of unknown composition.In this paper,gradient elution method separate it nitrate to the accurate determination of purpose.It was found that the solution of acetic acid for milk protein precipitation and filtration column followed by RP removal of lipid material samples.After purification,the sample directly was analyzed by the ion chromatograph,the volume of external standard.Stability test sample 5 times of the peak area nitrate average were 0.2961μS·min(RSD 0.35%),the average retention time was 26.721min(RSD 0.23%).Component recoveries were 99.04%and 99.43%,RSD were 1.85%and 1.02%.

Infant milk powder;Nitrate;Gradient elution;Ion chromatography

TS252.7

A

1001-2230（2010）01-0042-03

2010-07-08

黑龍江大學博士啟動金項目。

劉峰（1976-），男，助理研究員，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品質量安全。

孟利