趙婧，閆宏博，孫瑞秋，李慶章，高學軍

（東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

奶山羊乳腺組織中基因CCDC85B的克隆

趙婧，閆宏博，孫瑞秋，李慶章，高學軍

（東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

克隆奶山羊乳腺中基因CCDC85B。從本實驗室前期建立的基因文庫中挑選出CCDC85B的17 bp標簽，采用GLGI和RACE技術進行擴增，獲得基因的全長。結果表明，擴增片段長度為1 282 bp序列，其中編碼區(qū)為606 bp，編碼202個氨基酸殘基，BLAST比對結果顯示，該序列與已知牛、人CCDC85B的同源性分別為100%和83%，證明此基因確為奶山羊乳腺組織中的CCDC85B，為該基因的進一步結構分析和功能研究奠定基礎。

奶山羊；乳腺；CCDC85B；GLGI；RACE

0 引言

cDNA末端快速擴增技術以mRNA為模板，反轉錄合成cDNA的第一條鏈。然后用PCR擴增出從某個特定位點到3’端或5’端之間的未知核苷酸序列，該方法也被稱為錨定PCR（anchored PCR)[1]或單邊PCR（one-side PCR)[2]。如要研究同一基因家族的不同成員，可設計簡并引物[3-8]。

GLGI技術是將包括17bp的LongSAGE標簽和單一堿基dA、dC或dG與oligo-dT結合的錨定引物進行2次PCR擴增，最終得到的是含有SAGE標簽的長片段DNA擴增產物[9,10]。

CCDC85B基因是一個含有85B的螺旋結構域，參考國內外資料，其可能對脂細胞分化有影響，負向調節(jié)有絲分裂的克隆擴增，但具體在動物乳腺中的研究尚無報道。本實驗結合了RACE和GLGI兩種技術，成功地克隆出CCDC85B在奶山羊乳腺中的全長序列，為深入地進行基因結構分析和研究該基因的生物學功能奠定基礎。

1 材料

健康關中奶山羊泌乳期乳腺組織（本實驗室凍存的組織樣）；克隆載體pMD18-T，dNTP，各種DNA Marker，限制性內切酶SalⅠ，HindⅢ，KpnⅠ和LATaq DNA聚合酶（均購自大連蓮寶生物公司）；膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒（均購自AXYGEN公司）；Trizol（購自Invitrogene公司）；SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（購自Invitrogene公司）。

2 方法

從奶山羊乳腺組織中用Trizol法提取RNA，用逆轉錄酶MMLV反轉錄成cDNA，-20℃中保存。

2.1 SAGE-tag和GLGI分析

通用引物UPM為SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech）中提供；特異性引物GSP1為本實驗室前期建立的Long-SAGE基因庫中獲取的CCDC85B標簽前面加上CATG作為粘性末端。

引物序列如下：

UPM：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'

GSP1：5'-CATGCAGGAGGTGAATCGGCA-3'

經(jīng)過一次PCR擴增，將目的條帶純化，再與T載體連接后，轉化感受態(tài)細胞，篩選并鑒定陽性重組子后，測序。

2.2 5'RACE

重新設計并合成引物，序列如下：

GSP2：5'-CTGTGCCCTCAATCATCTGGGGA-3'

UPM:5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'

經(jīng)PCR擴增后，步驟同1.2.1。

2.3 序列的拼接及基因全長的獲得

將2.1以及2.2 PCR擴增的結果進行拼接，從而獲得全長序列。利用3’和5’末端信息設計引物，以5’-RACE-ready cDNA為模板進行擴增，通過長距離（LD）PCR獲得全長序列。

3 結果與分析

3.1 總RNA的含量和純度鑒定

3.1.1 總RNA含量和純度的紫外分光測定

提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計測得的OD260/OD280分別為1.93，OD260/OD280比值在1.8～2.0范圍內，表明無蛋白質、基因組DNA污染。

3.1.2 總RNA1.8%瓊脂糖凝膠電泳分析

總RNA經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳后可見兩條主帶28S和18S，且兩條主帶的亮度28S︰18S約為2︰1，隱約可見溴酚藍前面有一條很淺的條帶5S,說明提取的總RNA完整，未出現(xiàn)降解，可進行后續(xù)的實驗研究。

3.2 GLGI的結果

見有350 bp左右的條帶（圖1），膠回收后與pMD-T載體連接過夜，再連接感受態(tài)細胞后，進行陽性重組子的篩選，挑取單菌落搖菌6～8 h后提取質粒，質粒驗證結果見條帶與PCR膠回收條帶大小一致（圖2）。

圖1 GLGI PCR擴增結果

3.3 5’RACE結果

見有900 bp左右的條帶（圖3），膠回收后與pMD-T載體連接過夜，再連接感受態(tài)細胞后，進行陽性重組子的篩選，挑取單菌落搖菌6～8 h后提取質粒，質粒驗證結果見條帶與PCR膠回收條帶大小一致（圖4）。

3.4 基因全長的獲得

將3.2及3.3的結果進行拼接后，重新設計引物合成CCDC85B的全長，PCR的結果及質粒PCR驗證的結果如圖5和圖6所示。并使用SalⅠ做單酶切，用HindⅢ和KpnⅠ做雙酶切，結果如圖7所示。

將驗證后的質粒測序后，得到的序列如下（1 282 bp）：

BLAST同源性比對結果：（1）Bos taurus coiledcoil domain containing 85B（CCDC85B），mRNA，同源性為100%；（2）Homo sapiens coiled-coil domain containing 85B（CCDC85B），mRNA，同源性為83%。擴增片段長度為1 282 bp序列，其中編碼區(qū)（438-1046）為606 bp，編碼202個氨基酸殘基。

4 結論

本實驗從本課題組前期建立的Long-SAGE基因文庫中，挑選出CCDC85B基因的17 bp標簽作為基因特異性引物，通過GLGI技術和RACE技術的結合，經(jīng)過兩次PCR和長距離（LD）PCR成功地克隆出奶山羊乳腺組織中的基因CCDC85B的全長。目前國內外尚無對乳腺此基因研究的報道，為進一步進行該基因結構分析和研究該基因的生物學功能奠定了基礎。

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Amplification and cloning of CCDC85B sequence from mammary gland of dairy Goat

ZHAO Jing,YAN Hong-bo,SUN Rui-qiu,LI Qing-zhang,GAO Xue-jun
（Key Laboratory of Dairy Science Ministry of Education Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Cloning of CCDC85B sequence from mammary gland of dairy goat.The SAGE Tag was elongated by GLGI to several hundreds base pair of EST,and the full length gene sequence was obtained by 5’RACE.The sequence of gene CCDC85B contains 1282 bp nucleotides.The gene encodes 202 amino acid residues,and had the highest similarity with bos and,human,the percent identities being100%and 83%.The results showed that the gene CCDC85B was reliably gained,and established foundation for construction analysis and function study of the gene.

dairy Goat;mammary gland;CCDC85B;GLGI;RACE

Q78，TS252.1

A

1001-2230（2011）01-0012-03

2010-10-19

趙婧（1986-），女，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。

李慶章