鄧開(kāi)野，譚梅唇

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225；2.廣西大學(xué)，廣西南寧530004）

分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)合生產(chǎn)透明質(zhì)酸的研究

鄧開(kāi)野1，譚梅唇2

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225；2.廣西大學(xué)，廣西南寧530004）

采用單一補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)，產(chǎn)物合成以及副產(chǎn)物的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明：該方法可以通過(guò)改善發(fā)酵過(guò)程中環(huán)境條件，來(lái)提高透明質(zhì)酸（HA）的產(chǎn)量。和分批發(fā)酵相比，發(fā)酵液中HA的量提高大約3.5%。HA發(fā)酵可以采用單一補(bǔ)料分批發(fā)酵的方法來(lái)提高生產(chǎn)強(qiáng)度，縮短發(fā)酵周期，有效地降低生產(chǎn)成本，是一種可以有效提高HA發(fā)酵生產(chǎn)性能指標(biāo)的現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)。

分批發(fā)酵，補(bǔ)料分批發(fā)酵，透明質(zhì)酸

補(bǔ)料分批培養(yǎng)兼有分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，并在某種程度上克服了它們所存在的缺點(diǎn)。和分批培養(yǎng)方式相比，此方法可以解除培養(yǎng)過(guò)程中的底物抑制、產(chǎn)物的反饋抑制和葡萄糖的分解阻遏效應(yīng)；對(duì)于耗氧過(guò)程，可以避免在分批培養(yǎng)過(guò)程中因一次性投糖過(guò)多造成的細(xì)胞大量生長(zhǎng)、耗氧過(guò)多以致通風(fēng)攪拌設(shè)備不能匹配的狀況；在某種程度上可以減少微生物細(xì)胞的生成量、提高目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率；微生物細(xì)胞可以被控制在一系列連續(xù)的過(guò)渡態(tài)階段，可用來(lái)控制細(xì)胞的質(zhì)量；并可重復(fù)某個(gè)時(shí)期細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)渡態(tài)，可用于理論研究。和連續(xù)培養(yǎng)方式比較，此方法不需要嚴(yán)格的無(wú)菌條件；不會(huì)產(chǎn)生微生物菌中的老化和變異；最終產(chǎn)物濃度較高，有利于產(chǎn)物的分離，使用范圍廣［1－2］。本研究對(duì)分批培養(yǎng)和單一補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式進(jìn)行了比較研究，考察了葡萄糖的變化狀況，以及分別采用兩種方式生產(chǎn)HA過(guò)程中，菌體的生長(zhǎng)、HA的合成和發(fā)酵副產(chǎn)物乳酸的變化情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種 實(shí)驗(yàn)室篩選和誘變出的產(chǎn)生透明質(zhì)酸的變異株；種子培養(yǎng)基 2%淀粉葡萄糖水解液，蛋白胨1%，酵母膏 1%，NaNO30.4%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，調(diào)pH7.0，121℃滅菌20min；發(fā)酵培養(yǎng)基 4%淀粉葡萄糖水解液，蛋白胨1%，酵母膏1%，硝酸鈉0.5%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，調(diào)pH7.0，121℃滅菌20min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 斜面與種子培養(yǎng)方法 將篩分的菌種于斜面培養(yǎng)基上劃線(xiàn)傳代。將斜面試管放在恒溫箱中，在37℃條件下培養(yǎng)14～16h。培養(yǎng)結(jié)束后，用接種針在斜面培養(yǎng)基中挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落2～3環(huán)，接入250mL三角燒瓶中，燒瓶?jī)?nèi)裝50mL種子培養(yǎng)基，把接菌后密封好的250mL三角燒瓶置于以200r/min旋轉(zhuǎn)的搖床中培養(yǎng)16h，培養(yǎng)溫度37℃。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)方法 培養(yǎng)結(jié)束后，按10%的接種量計(jì)算，從250mL三角燒瓶中吸取0.2mL已培養(yǎng)好的菌液，接入500mL三角燒瓶，內(nèi)裝發(fā)酵培養(yǎng)基20mL。再將此500mL三角瓶置于轉(zhuǎn)速為200r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)，在37℃條件下培養(yǎng)24h。

1.2.3 分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)比較

1.2.3.1 分批培養(yǎng) 于10L的發(fā)酵罐（江蘇達(dá)森）中加入6L發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃下滅菌30min，初始攪拌轉(zhuǎn)速 100r/min，不斷地提高轉(zhuǎn)速，直到轉(zhuǎn)速達(dá)到200r/min。接種后開(kāi)始主發(fā)酵直至發(fā)酵結(jié)束，從發(fā)酵液中提取HA。分批發(fā)酵淀粉水解液的初始葡萄糖濃度為5%。

1.2.3.2 補(bǔ)料分批培養(yǎng) 在10L的發(fā)酵罐中加入4L的發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃下滅菌30min，初始攪拌轉(zhuǎn)速100r/min，不斷地提高轉(zhuǎn)速，直到轉(zhuǎn)速達(dá)到200r/min。初始葡萄糖濃度為3%，每隔一段時(shí)間，取樣分析發(fā)酵液中的葡萄糖含量，待發(fā)酵體系中葡萄糖濃度1%時(shí)，便補(bǔ)加葡萄糖濃度為5%的新鮮培養(yǎng)基，控制發(fā)酵體系中的葡萄糖濃度為2%，直至發(fā)酵液的總體積為6L為止，便停止補(bǔ)料。

1.2.4 測(cè)定方法

1.2.4.1 吸光度（OD值）的測(cè)定 發(fā)酵液50mL在4000r/min條件下離心15min后，在上清液中加入3倍體積的乙醇，析出的沉淀加入與發(fā)酵液同體積的0.1mol/L NaCl溶液，置于磁力攪拌器，在196nm處測(cè)定發(fā)酵液的吸光度，該吸光度值的大小可以指示發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量的高低。

1.2.4.2 菌體含量的測(cè)定 采用干重法。將發(fā)酵液離心后取沉淀，加稀酸溶解碳酸鈣，再離心取沉淀，80℃干燥24h后，稱(chēng)取重量，計(jì)算細(xì)胞濃度。

1.2.4.3 乳酸含量測(cè)定 對(duì)羥基聯(lián)苯法［3］。

1.2.4.4 其他指標(biāo)的測(cè)定 透明質(zhì)酸含量測(cè)定：采用Bitter－Muir氏法［4］；比旋光度的測(cè)定：稱(chēng)取5mg HA，用蒸餾水溶解后，裝入10cm比旋管，在比旋儀上測(cè)定；葡萄糖含量測(cè)定：3，5－二硝基水楊酸法［5］。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外吸收光譜

將sigma公司的HA標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵液的提取物均分別配制成500!g/mL的水溶液，使用紫外分光光度計(jì)在190～300nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。兩者均在波長(zhǎng)196nm處出現(xiàn)多糖特征峰。標(biāo)準(zhǔn)樣品HA和發(fā)酵液提取物的紫外掃描結(jié)果分別如圖1和圖2所示。

圖1 HA標(biāo)準(zhǔn)品的紫外圖譜

圖2 發(fā)酵液提取物的紫外圖譜

從圖中可以看出，發(fā)酵液提取物的粗品HA的紫外光譜在196nm處有特征吸收峰，同sigma公司的HA標(biāo)準(zhǔn)品的特征吸收峰相同，表明利用其最大波長(zhǎng)處紫外光譜分析可以作為衡量發(fā)酵液中HA含量多少的依據(jù)。

2.2 分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)的葡萄糖濃度的變化

圖3為分批發(fā)酵過(guò)程和補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖濃度的變化曲線(xiàn)。由圖可知，在分批發(fā)酵過(guò)程中，葡萄糖的初始濃度值較高，為5%，由于在整個(gè)過(guò)程中沒(méi)有再補(bǔ)充，所以一直呈下降的趨勢(shì)，待菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期時(shí)，底物中葡萄糖的含量不是很高，對(duì)產(chǎn)物的積累有一定的抑制作用，而且由于初期的高葡萄糖濃度，容易造成中間產(chǎn)物的積累，如乳酸等，又會(huì)對(duì)產(chǎn)物也形成抑制作用。

圖3 分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)的葡萄糖消耗曲線(xiàn)

而補(bǔ)料分批培養(yǎng)則克服了上述的缺點(diǎn)，初始的葡萄糖濃度為3%，當(dāng)?shù)孜锏钠咸烟菨舛冉档偷?%左右時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)加新鮮的培養(yǎng)基。這樣度過(guò)了滯后期的菌體在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期中，可以處于比較穩(wěn)定的環(huán)境中進(jìn)行生長(zhǎng)和產(chǎn)物的積累，對(duì)獲得高得率產(chǎn)物有促進(jìn)作用。

2.3 分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

圖4 分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

由圖4可知，在主發(fā)酵前期，兩種培養(yǎng)方式對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響并沒(méi)有太大的差別。分批培養(yǎng)過(guò)程中，菌體量呈穩(wěn)定的上升趨勢(shì)，在12～16h范圍內(nèi)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，因此菌體量增加速度較快，而穩(wěn)定期則是在16～22h，然后開(kāi)始呈下降趨勢(shì)。而從補(bǔ)料分批培養(yǎng)的菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)可以明顯地看出，菌體在6h左右就開(kāi)始迅速增長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之后，由于補(bǔ)充了新鮮的培養(yǎng)基，此時(shí)發(fā)酵液中的養(yǎng)分比較完全，所以，在14～26h范圍內(nèi)，菌體處于穩(wěn)定期內(nèi)，此培養(yǎng)方式可以令菌體的穩(wěn)定期維持較長(zhǎng)時(shí)間，這是任何一種工業(yè)發(fā)酵所期望的，因?yàn)殚L(zhǎng)的穩(wěn)定期可以促使產(chǎn)物的積累，延長(zhǎng)產(chǎn)物積累時(shí)間，就意味著產(chǎn)率的提高。

2.4 分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式對(duì)HA合成的影響

由圖5可以看出，采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)的方式，在發(fā)酵液中HA的積累速度要快于分批培養(yǎng)中產(chǎn)物的積累，并且從產(chǎn)物積累開(kāi)始，HA的量就高于分批培養(yǎng)發(fā)酵液中HA的含量，這和圖3和圖4所獲得的結(jié)果相偶聯(lián)。

圖5 分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)對(duì)HA合成的影響

2.5 分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式對(duì)乳酸合成的影響

鏈球菌的生長(zhǎng)都伴隨著乳酸的形成，乳酸和乙酸是其中最主要的兩種。不過(guò)乙酸的形成量很少，只是乳酸的10%，所以本研究忽略了乙酸，對(duì)此不做分析。圖6為分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中乳酸的變化曲線(xiàn)。然而，乳酸的大量形成，對(duì)HA的合成會(huì)產(chǎn)生抑制。

圖6 分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)對(duì)乳酸合成的影響

由圖6可以看出，對(duì)于分批發(fā)酵，從6h開(kāi)始到16h左右，發(fā)酵液中乳酸的增加比較迅速，而最大值可達(dá)到61.4g/L。而補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程中，乳酸的量則一直呈上升的趨勢(shì)，且含量比較高。這是由于和分批培養(yǎng)相比較，補(bǔ)料的操作使得培養(yǎng)液中的葡萄糖含量在發(fā)酵后期要高些，這是因?yàn)樵摼晟L(zhǎng)代謝所需要的能量主要依靠葡萄糖不完全代謝而生成乳酸和乙酸所提供，所以在整個(gè)補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中，乳酸的量一直在增加。

3 結(jié)論

3.1 本研究采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)，產(chǎn)物合成及副產(chǎn)物的影響來(lái)看，該方法可以通過(guò)改善發(fā)酵過(guò)程中環(huán)境條件，來(lái)提高HA的產(chǎn)量。和分批發(fā)酵相比，發(fā)酵液中HA的量提高大約3.5%。

3.2 HA發(fā)酵可以采用補(bǔ)料分批發(fā)酵的方法來(lái)提高生產(chǎn)強(qiáng)度，縮短發(fā)酵周期，有效地降低生產(chǎn)成本，是一種可有效提高HA發(fā)酵生產(chǎn)性能指標(biāo)的現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)。

［1］郭學(xué)平，王春喜，崔大鵬.發(fā)酵法制備透明質(zhì)酸［J］.日用化學(xué)工業(yè)，1994（2）：47.

［2］郭學(xué)平，王春喜，凌沛學(xué)，等.透明質(zhì)酸及其發(fā)酵生產(chǎn)概述［J］.中目生化藥物雜志，1998，19（4）：209.

［3］Barker S B，Summerson W H.The Colorimetric determination of lactic acid in biological material［J］.J Biol Chem，1949，138：535－554.

［4］Bitter T，Ewins R.Modified carbazole reaction for uronic acid［J］.J Biol Chem，1961，81：43.

［5］Miller G L.Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Anal Chem，1960，31（3）：426－428.

Study on producing hyaluronic acid by compound of batch fermentation and batch－feeding fermentation

DENG Kai－ye1，TAN Mei－chun2
（1.College of Light Industry and Food Technology，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China；2.Guangxi University，Nanning 530004，China）

The single batch－feeding fermentation was adopted.The biomass growth，product synthesis，effects of byproducts were studied during the course of fermentation.The results showed it could improve the HA yield through improving the environmental condition during the course of fermentation.Comparing with batch fermentation，HA yield could be increased 3.5%.HA fermentation can improve the production intensity，shorten fermentation period，decrease the cost by single batch feeding fermentation.

batch fermentation；batch－feeding fermentation；hyaluronic acid

TS201.1

A

1002－0306（2011）01－0166－03

2010－01－06

鄧開(kāi)野（1968－），女，博士，副教授，研究方向：發(fā)酵工程。