顏家渝，黃映紅，曾潔萍

口腔扁平苔蘚(Oral Lichen Panus，OLP)是常見的非感染性口腔粘膜病變，具有發(fā)病率高、病程遷延難愈、有癌變傾向等特點。OLP主要發(fā)生人群是40歲以上的成年人，但是年輕人和兒童也會發(fā)生，約占患者總數(shù)的2% ～3%，OLP在成人中的患病率約為0.51%［1］。OLP病程遷延，易反復(fù)發(fā)作，部分反復(fù)發(fā)作的病人可發(fā)展為口腔鱗癌。由于日漸增多的OLP癌變病例的危險報告被提出，因此WHO已將OLP定義為癌前狀態(tài)疾?。?］。OLP發(fā)病機制的探討一直是口腔醫(yī)學的研究熱點之一。有研究表明，OLP存在著多基因表達調(diào)控的改變，可能與其發(fā)生和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)［3～4］。據(jù)文獻綜合表明［5～8］，陰虛火旺是 OLP 最常見的中醫(yī)臨床證候。此型通常伴口腔粘膜充血，糜爛，易發(fā)生癌變［9］，故本研究重點為陰虛火旺型的OLP。

miRNA是一種極短的，在體內(nèi)自然存在的約含21～22個堿基的RNA分子，是由Dicer酶加工具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90個堿基大小的單鏈RNA前體而來，miRNA通過和靶基因mRNA互補序列配對引導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA或抑制蛋白的翻譯。miRNA在細胞生長和凋亡、血細胞分化、同源異形盒基因調(diào)節(jié)、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生、胚胎后期發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。因此，為進一步探明OLP患者的特異性基因表達調(diào)控，本研究運用基因芯片技術(shù)篩選OLP相關(guān)的miRNAs，探索口腔扁平苔蘚的中醫(yī)證候研究方法，探討陰虛火旺型口腔扁平苔蘚的基因表達特征及靶基因信號通路調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

白細胞保存液(孝感奧華醫(yī)療科技有限公司)、EDTA(江西省容和實業(yè)有限責任公司)、紅細胞裂解液(C3702，江蘇海門市碧云天生物技術(shù)研究所)、mir-Vana RNA Isolation Kit(美國 Ambion公司)、miRNAs芯片SANGER11.0版本(美國Affymetrix公司)等。

超凈工作臺SW－CJ－1F(蘇州市安泰空氣技術(shù)有限公司)、Heraeus冷凍離心機(Me gafu ge1.0R，德國)、eppendorf加樣槍(1403853，德國)、SANYO 超低溫冰箱(MDF－382E，日本)等。

1.2 臨床病例樣本采集

1.2.1 臨床病例收集

2008年9月至2010年8月在成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院口腔粘膜病專病門診，并經(jīng)臨床及病理學檢查確診的OLP患者20例，按中醫(yī)辨證分型［10］，篩選陰虛火旺型口腔扁平苔蘚病例3例，其中男2例，女性1例。對照組3例健康者，其中男性2例，女性1例。各組均排除感染性、心血管、自身免疫、過敏性、腫瘤、精神性疾病等。

1.2 .2 樣本采集

晨空腹常規(guī)靜脈采血2 mL，加入EDTA抗凝，4℃保存待用。在超凈工作臺上分別吸取6 mL紅細胞裂解液到6個15 mL離心管，離心管編號1～6號。將回復(fù)到室溫的抗凝全血搖勻后，吸取2 mL分別加到6個離心管中，顛倒6～8次，并倒置輕彈管壁混勻。室溫放置5分鐘并輕彈數(shù)次幫助裂解紅細胞，搖勻，3000 rpm離心5分鐘，棄上清液，留下管底白細胞團和大約10 μL的殘留上清液。6個離心管均加入紅細胞裂解液重復(fù)離心1次，吸凈上清，加入mirVana RNA Isolation Kit 1 mL，吹勻并移入12個凍存管，對應(yīng)離心管分別編號 1－1、1－2、2－1、2－2、3－1、3－2、4－1、4－2、5－1、5－2、6－1、6－2，－80℃保存。

1.3 miRNAs微陣列分析

芯片采用美國Affymetrix公司生產(chǎn)的miRNA芯片SANGER11.0版本，每片含1769條探針，其中人類miRNA700個。

1.3.1 芯片制作與掃描

提取TotleRNA，采用凝膠電泳和紫外分光光度計質(zhì)量檢測，探針標記與雜交，洗片后晾干后掃描。

1.3.2 統(tǒng)計學方法

采用SAM軟件，P值小于0.05視為表達有差異。

2 結(jié)果

2.1 樣品RNA的質(zhì)量判定

TotleRNA質(zhì)量檢測及分離純化的小分子RNA均符合miRNA芯片要求。探針標記與雜交、洗片過程質(zhì)控合格，掃描數(shù)據(jù)可分析。

2.2 差異表達的miRNAs

尋找到5個OLP患者和正常人有表達差異的miRNA(表1)。

表1 差異表達的miRNAs列表

2.3 hsa－miR－18a miRNA基因相關(guān)的12個有統(tǒng)計學意義靶基因通路(表2)

2.4 hsa－miR－99b miRNA基因相關(guān)的2個有統(tǒng)計學意義靶基因通路(表3)

3 討論

OLP病因及發(fā)病機制至今尚不明確，一般認為與精神、內(nèi)分泌、免疫、感染等全身因素有關(guān)。OLP發(fā)病機制的探討一直是口腔醫(yī)學的研究熱點。有研究表明，OLP存在著多基因表達調(diào)控的改變，可能與其發(fā)生及疾病的轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)［11］。范媛［12］等利用基因芯片篩選出OLP相關(guān)的差異表達基因213條，主要涉及免疫相關(guān)基因，代謝相關(guān)基因，以及DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄因子、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)基因。許彥枝［13］等則應(yīng)用含有332050個位點的人類基因組芯片進行雜交，篩選出114條差異表達基因，并總結(jié)了ERBB3、SYN2、GIT1、CD72等幾條基因在OLP發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。同時，許彥枝［14］等也研究了OLP的表達通路，結(jié)論為應(yīng)用基因表達譜芯片可初步篩選出OLP差異表達基因和通路，OLP發(fā)生、發(fā)展過程中存在著多個不同基因及多條功能通路表達調(diào)控的改變。但目前尚無對基因表達調(diào)控的重要環(huán)節(jié)miRNA的分析。探討OLP與miRNA的相關(guān)性，將為OLP的分子機制學研究開拓全新的思路。

表2 hsa－miR－18a miRNA對應(yīng)12個靶基因通路列表(p－value＜0.01)

表3 hsa－miR－99b miRNA對應(yīng)2個靶基因通路列表(p－value＜0.05)

miRNA是一類新近發(fā)現(xiàn)的，在基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起重要作用的小分子。在高等真核生物中廣泛表達的miRNA是經(jīng)過Dicer加工之后的一類非編碼的小RNA分子。在哺乳動物中，miRNA通常在翻譯水平上調(diào)節(jié)基因表達，miRNA的數(shù)量與每個位點上翻譯沉默的水平是協(xié)同相關(guān)的［15］，由于互補序列的存在，miRNA能夠與特異的mRNA3＇非翻譯區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制，從而起到對基因表達負調(diào)節(jié)作用或基因沉默［16］。雖然miRNA基因在人類的基因組中只占很小一部分，但它是機體發(fā)育和細胞穩(wěn)態(tài)維持的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。每個miRNA可有多個靶基因，多個miRNA也可調(diào)控同一靶基因［17］，這一特點體現(xiàn)了miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的經(jīng)濟性和精密性。

經(jīng)Kegg及Biocarta數(shù)據(jù)庫分析，hsa－miR－18a相關(guān)的有統(tǒng)計學意義的信號通路共12條，包括CD40L信號通路、TNFR2信號通路、NF－KB信號通路、p53信號通路等。hsa－miR－18a的上調(diào)，使相應(yīng)信號通路效應(yīng)物的活性抑制或濃度改變。其中TNFR2信號通路的抑制，可能與OLP病變部位細胞凋亡減弱有關(guān)。而p53信號通路抑制，導(dǎo)致抑癌基因p53表達下調(diào)，與細胞惡性增殖密切相關(guān)，GirodS 與 Rajaram G［18～19］認為p53基因突變可能與口腔黏膜癌變的早期階段有關(guān)。

本實驗數(shù)據(jù)分析指出hsa－miR－99b相應(yīng)有統(tǒng)計學意義信號通路包括細胞粘多糖(肝素)合成和細胞粘多糖降解通路兩條。有研究表明，CD淋巴細胞通過產(chǎn)生肝素酶穿過黏膜下層基板區(qū)，形成淋巴細胞浸潤帶，介導(dǎo)扁平苔蘚的炎癥反應(yīng)［20］。故根據(jù)本研究結(jié)果可推測hsa－miR－99b的表達下調(diào)可與OLP病變部位粘多糖成分肝素的合成分解紊亂有關(guān)。

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