邊 琳 李連之 王 霞 黃 蕾 蒲雪煒 董建方

(聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，聊城 252059)

混配氧釩配合物[VO(Naph-Phe)(Phen)]的合成、晶體結(jié)構(gòu)及與DNA作用研究

邊 琳 李連之＊王 霞 黃 蕾 蒲雪煒 董建方

(聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，聊城 252059)

合成了一個新的L-苯丙氨酸萘酚醛希夫堿(Naph-Phe)和鄰菲咯啉(Phen)混配氧釩配合物[VO(Naph-Phe)(Phen)]，通過元素分析和紅外光譜進行了表征。X-射線單晶衍射分析表明，該晶體屬于單斜晶系，P21/c空間群，晶胞參數(shù)為：a=1.02785(11)nm，b=2.1865(3)nm，c=1.171150(13)nm，β=94.7470(10)°，V=2.6229(4)nm3，Z=4，F(xiàn)(000)=1164，R1=0.0767，wR2=0.1655，S=1.092。利用紫外吸收光譜、熒光光譜、圓二色光譜和粘度測量等研究了配合物與小牛胸腺DNA(CT-DNA)的作用，結(jié)果表明配合物以插入方式與CT-DNA作用。瓊脂糖凝膠電泳法研究了配合物與pBR322 DNA的作用，表明它可切割超螺旋型DNA為缺刻型DNA。

釩配合物；希夫堿；晶體結(jié)構(gòu)；DNA

金屬配合物與DNA的相互作用一直是化學(xué)生物學(xué)的研究熱點[1-2]。許多金屬配合物能與DNA結(jié)合并切割DNA，例如抗癌藥物博來霉素的DNA切割活性就依賴于與金屬離子的配合。因此，近年來人們致力于合成以DNA為靶點的金屬配合物藥物，并研究它們與DNA的相互作用及機理。釩是人體必需的微量元素，其配合物具有抗腫瘤、抗癌、類胰島素樣等生物活性[3-6]。氨基酸希夫堿與第一過渡金屬元素形成的配合物表現(xiàn)了良好的抗菌、抗結(jié)核等生物活性[7]。1，10-鄰菲咯啉是一種重要的雜環(huán)配體，其配合物具有DNA結(jié)合性和DNA切割活性[8-9],是潛在的抗腫瘤藥物。我們實驗室已合成出一系列以希夫堿與1，10-鄰菲咯啉為配體的氧釩配合物[10-13]。本文報道了L-苯丙氨酸萘酚醛希夫堿(Naph-Phe)及1，10-鄰菲咯啉(Phen)混配體氧釩配合物的合成表征及晶體結(jié)構(gòu)，并用紫外吸收光譜、熒光光譜、圓二色光譜和粘度測量等研究了它與小牛胸腺DNA(CT-DNA)相互作用，還利用瓊脂糖凝膠電泳法研究了配合物對pBR322 DNA的切割活性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

溴化乙錠 (EB)、瓊脂糖和小牛胸腺DNA(CTDNA)均購自華美生物工程公司，CT-DNA用10 mmol·L-1Tris-HCl/10 mmol·L-1NaCl，pH 7.1 緩沖溶液配制，經(jīng)UV譜測定A260/A280＞1.8，濃度以ε260=6600 L·mol-1·cm-1確定[14]。 三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自濟南愛博經(jīng)貿(mào)有限公司，L-苯丙氨酸 (生化試劑)購自北京經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司，硫酸氧釩、1，10-鄰菲咯啉和 2-羥基-1-萘甲醛(萘酚醛)等均為分析純試劑。

Bruker Smart-1000 CCD型衍射儀，Nicolet 460型紅外光譜儀，Perkin-Elmer 2400Ⅱ型元素分析儀，HP 8453A型紫外-可見分陣列二極管分光光度計 (USA)，LS55 型熒光光譜儀 (Perkin Elmer，USA)，JASCO J-810型圓二色光譜儀(Japan)，烏氏粘度計，Powerpac 300 電泳儀(Bio-Rad)，DYY-Ⅲ電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.2 配合物的合成

將 1.0 mmol L-苯丙氨酸和 1.0 mmol氫氧化鉀溶于5 mL無水甲醇中，加熱攪拌直至完全溶解后，向溶液中逐滴加入1 mmol萘酚醛的無水甲醇溶液(5 mL)，于60℃下攪拌1 h。然后加入1 mmol硫酸氧釩的水溶液(2 mL)，加熱回流反應(yīng)2 h后，繼續(xù)加入1 mmol 1，10-鄰菲咯啉的無水甲醇溶液 (5 mL)。加熱攪拌3 h后，冷卻過濾，沉淀用二氯甲烷與無水甲醇的混合溶液溶解，過濾，濾液室溫下靜置數(shù)天，得到適合單晶衍射的紅褐色晶體。產(chǎn)率約為60%。元素分析按 C32H23N3O4V 計算值(%):C 68.03,H 4.08，N 7.44；實測值(%)：C 67.97，H 4.00，N 7.32。 配合物的 IR(cm-1)：3 435.8(s，νO-H)；1 647.3(vs，νC=N)；1 620.9(vs，νCOO)；935.7(s，νV=O)；447.5(w，νV-N)。

1.3 晶體結(jié)構(gòu)測定及解析

選取尺寸為 0.40 mm×0.36 mm×0.30 mm 的單晶置于Bruker Smart-1000 CCD型衍射儀上，以石墨單色化的 Mo Kα(λ=0.071073 nm)輻射為光源,在1.86°≤θ≤25.02°范圍內(nèi)以 φ-ω 掃描方式于 298(2)K下共收集衍射點12 694個，其中獨立衍射點4 503 個(Rint=0.094 6)，選取 I＞2σ(I)的 2 623 個可觀察點用于結(jié)構(gòu)解析和修正，全部數(shù)據(jù)均經(jīng)經(jīng)驗吸收校正。晶體結(jié)構(gòu)解析和結(jié)構(gòu)精修均采用SHELXTL軟件完成[15]。結(jié)構(gòu)由直接法解出，其余的非氫原子的坐標(biāo)在以后的數(shù)輪差值Fourier合成中陸續(xù)確定。對全部非氫原子的坐標(biāo)及各向異性參數(shù)進行了全矩陣最小二乘法修正。最終的偏差因子為R1=0.0767，wR2=0.1655，S=1.092。差值電子密度最高和最低峰分別為 768 e·nm-3和-300 e·nm-3，主要晶體學(xué)數(shù)據(jù)列于表1。

CCDC：770157。

表1 配合物的晶體學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographic data for the title complex

1.4 配合物與DNA作用的實驗方法

1.4.1 紫外吸收光譜測定

反應(yīng)體系為 10 mmol·L-1Tris-HCl/10 mmol·L-1NaCl，pH 7.1緩沖溶液。固定配合物的濃度為 20 μmol·L-1，逐漸增大 CT-DNA 的濃度，反應(yīng)溶液混合均勻后靜止1 h，以緩沖溶液或含相同濃度DNA緩沖溶液為參比，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，分別測定不同DNA濃度下配合物與DNA混合溶液的紫外吸收光譜。

1.4.2 配合物對EB-DNA熒光光譜影響的測定

反應(yīng)體系為 10 mmol·L-1Tris-HCl/10 mmol·L-1NaCl，pH 7.1緩沖溶液。固定 CT-DNA濃度為 25 μmol·L-1，EB 濃度為 3 μmol·L-1， 逐漸增大配合物的濃度，將反應(yīng)溶液混合均勻靜止2 h進行測量。儀器測量參數(shù)：激發(fā)波長為258 nm；狹縫寬度為5 nm；掃描波長范圍為540～700 nm。

1.4.3 圓二色光譜測定

反應(yīng)體系為 10 mmol·L-1Tris-HCl/10 mmol·L-1NaCl，pH 7.1緩沖溶液。固定CT-DNA的濃度為10 mmol·L-1，逐漸增加配合物的濃度，混合均勻后室溫靜止2 h后，分別測定DNA溶液和配合物與DNA混合液的圓二色光譜。設(shè)置儀器參數(shù)：掃描速度為100 nm·min-1；分辨率為 0.2 nm；累計次數(shù) 3 次；路徑長度為1 cm；波長范圍為220～320 nm。

1.4.4 粘度測量

反應(yīng)體系為 10 mmol·L-1Tris-HCl/10 mmol·L-1NaCl，pH 7.1緩沖溶液。 固定CT-DNA的濃度100 μmol·L-1，依次增加配合物的濃度，溫度恒定在(30±0.1)℃，分別測定不同 r值(r=cVOL/cDNA，cVOL為配合物的濃度)下配合物(或EB)與DNA混合液流經(jīng)毛細管的時間t，每個樣品溶液重復(fù)測定時間3次，取平均值。 后根據(jù)相對粘度公式 η=(t-t0)/t0，以(η/η0)1/3對 r作圖，其中t0為緩沖溶液流經(jīng)毛細管所需的時間，η0為r=0時DNA溶液的相對粘度。

1.4.5 瓊脂糖凝膠電泳實驗

固定質(zhì)粒pBR322 DNA的濃度，逐漸增加配合物的濃度，混合均勻，37℃水浴溫?zé)? h后進行電泳分析。在0.8%的瓊脂糖凝膠上，60 V的電壓下電泳約2 h，電泳溶液為TBE緩沖溶液。取出凝膠，在凝膠成像分析系統(tǒng)上照相。

2 結(jié)果與討論

2.1 晶體結(jié)構(gòu)解析

配合物的主要鍵長和鍵角列于表2，配合物的晶體結(jié)構(gòu)見圖1。分子結(jié)構(gòu)表明，釩(Ⅳ)為六配位，V(1)-O(4)的鍵長為 0.160 0(3)nm，為典型的釩氧雙鍵 (V=O)[16]。由表2中配合物的相關(guān)鍵長和鍵角可知，釩原子處于變形的八面體配位環(huán)境中，三齒的L-苯丙氨酸萘酚醛Schiff堿配體上的酚羥基O(3)原子、亞氨基 N(1)原子、羧基 O(1)原子和 1，10-鄰菲咯啉配體上的N(3)原子處于變形八面體的赤道平面，而釩氧O(4)原子和1，10-鄰菲咯啉上的N(2)原子則占據(jù)八面體的軸向位置。O(4)原子和N(2)原子距離中心釩原子的距離分別為 0.1600(3)和0.2399(4)nm，中心釩原子偏向O(4)原子一方，偏離赤道平面的距離為0.03792(19)nm。O(4)和N(2)距離赤道平面的距離則分別為0.19747(36)和0.20052(41)nm。

圖1 配合物的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of the complex

表2 配合物的主要鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and angles(°)for the complex

另外，以V(1)原子為中心形成了一個五元環(huán)V(1)-O(1)-C(1)-C(2)-N(1)和一個六元環(huán)V(1)-O(3)-C(12)-C(11)-C(10)-N(1)，六元環(huán)與五元環(huán)所處的平面形成的二面角為17.88(18)°。說明這兩個環(huán)的共面性不是很好，但是它們的形成卻可以增加配合物的穩(wěn)定性。在配合物的晶體結(jié)構(gòu)中，分子間通過弱的分子間氫鍵(表3)等相互作用彼此連接，形成了一維鏈狀結(jié)構(gòu)(圖 2)。

表3 配合物的氫鍵鍵長和鍵角Table 3 Hydrogen bond lengths and angles for the complex

圖2 配合物的一維鏈狀圖Fig.2 One-dimensional chain structure of the complex

2.2 配合物與DNA的作用

2.2.1 紫外吸收光譜

紫外吸收光譜是研究配合物與DNA作用的常用方法。含雜環(huán)配體的配合物在紫外區(qū)有一定的電子吸收，當(dāng)保持配合物的濃度不變，而逐漸增大DNA的濃度后，若配合物的吸光度減少，波長紅移，即減色紅移效應(yīng)可認(rèn)為配合物與DNA發(fā)生了插入作用[17-18]。由于插入配體與DNA堿基對發(fā)生了π電子堆積，配體的π*空軌道與堿基的π電子軌道發(fā)生偶合，使能級下降，導(dǎo)致π-π*躍遷的能量減少，從而發(fā)生紅移現(xiàn)象；同時，偶合后的π*軌道因部分填充電子，使π-π*躍遷幾率減少，產(chǎn)生減色效應(yīng)[18-19]。減色紅移效應(yīng)與配合物的插入程度也有關(guān)系，減色效應(yīng)越明顯，吸收峰紅移越大，說明配合物插入程度越強。

在不同濃度的CT-DNA存在時，配合物的紫外吸收光譜如圖3。由圖3可知，配合物與DNA作用后其吸收光譜隨DNA濃度的逐漸增大而發(fā)生明顯的減色效應(yīng)，說明配合物與DNA可能發(fā)生了插入作用。為定量研究配合物與DNA作用程度的強弱，由方程 cDNA/(εa-εf)=cDNA/(εb-εf)+1/[Kb(εb-εf)]可求得結(jié)合常數(shù) Kb[20]。εa為配合物的表觀摩爾吸光系數(shù)，εb、εf分別為鍵合和自由配合物的摩爾吸光系數(shù)，Kb為配合物與 DNA 的結(jié)合常數(shù)。將-cDNA/(εa-εf)對 cDNA作圖(圖3內(nèi)嵌圖)，通過斜率與截距之比即可得到結(jié)合常數(shù)Kb=2.97×104L·mol-1。遠小于比以經(jīng)典插入方式與 DNA 結(jié)合的 EB(Kb=3.3×105L·mol-1[21])。 這說明，配合物與DNA以插入方式結(jié)合，但插入能力小于EB。

圖3 不同濃度CT-DNA存在下配合物的紫外吸收光譜Fig.3 Absorption spectra of the complex in the absence and presence of CT-DNA

2.2.2 熒光光譜

溴化乙錠為具有共軛芳香環(huán)的扁平分子，本身熒光極弱，當(dāng)它專一插入DNA分子的堿基對時，其體系的熒光大為加強[22]。而當(dāng)其它不產(chǎn)生熒光的分子也可以與DNA發(fā)生插入作用時，會與EB競爭DNA堿基對的作用位點，使EB-DNA的熒光強度大為減弱即發(fā)生了熒光猝滅，因而EB可作為配合物與DNA作用的結(jié)構(gòu)探針。

由配合物與EB競爭實驗的熒光光譜圖 (圖4)可見，在EB-DNA體系中逐漸增加配合物的濃度，體系的熒光強度明顯減弱，可以推斷配合物分子可能與CT-DNA發(fā)生了插入作用，將EB分子從EBDNA體系中擠出。熒光猝滅行為遵循Stern-Volmer方程[18]。

I0為不加配合物時EB-DNA體系的熒光強度，I為添加不同濃度配合物時配合物與EB-DNA體系的熒光強度，Ksq為猝滅常數(shù)，r=cVOL/cDNA。經(jīng)I0/I vs r作圖(內(nèi)嵌圖)可求得Ksq為1.60。此值與以前報道的配合物[VO(Naph-Glu)(Phen)]的Ksq(0.33)[10]相比要大，但比配合物[Cu2(Dmbiim)4(H2O)2]4+的Ksq(2.39)[23]卻小。這與這些配合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖4 配合物對EB-DNA體系熒光光譜的影響Fig.4 Effects of the complex on the fluorescence spectra of EB-DNA system

2.2.3 圓二色(CD)光譜

CT-DNA是手性生物大分子，其旋光性是由于組成核苷酸的戊糖具有不對稱碳原子，因此在吸收區(qū)域具有圓二色性。CT-DNA的CD光譜中有兩個明顯的特征峰，273 nm左右的正峰是由CT-DNA堿基對的π-π堆積作用引起的，244 nm左右的負(fù)峰則主要是由于DNA的右手螺旋性[24]。當(dāng)DNA溶液中加入其它小分子后，由于小分子與DNA作用，特別是插入到DNA堿基對時，會影響堿基對之間的作用，使DNA的構(gòu)象發(fā)生變化，從而引起DNA的CD譜發(fā)生變化[25]。

配合物與CT-DNA作用的圓二色光譜如圖5所示，當(dāng)相同DNA濃度的溶液中逐漸增加配合物的濃度后，CD光譜正峰的橢圓率逐漸增大，負(fù)峰基本不變，說明配合物與DNA發(fā)生了插入作用，且主要是影響了DNA堿基對之間的π-π堆積作用。這與紫外吸收光譜和熒光光譜的結(jié)論是一致的。

圖5 配合物對CT-DNA圓二色光譜的影響Fig.5 Effects of the complex on CD spectra of CT-DNA

2.2.4 粘度測量

在缺少晶體結(jié)構(gòu)證據(jù)的情況下，粘度測量是檢測溶液狀態(tài)下配合物與DNA作用模式的重要手段[26]。當(dāng)配合物以插入模式與DNA作用時，堿基對之間的距離將變大以容納進入的配體，導(dǎo)致DNA雙螺旋伸長，則溶液粘度增加；當(dāng)配合物以靜電或溝面結(jié)合等非插入模式與DNA作用時，粘度沒有明顯的變化；當(dāng)配合物以部分插入模式與DNA作用時，會造成DNA雙螺旋扭結(jié)，使DNA粘度減小。圖6為配合物和EB對CT-DNA相對粘度的影響曲線。從圖6中可以看出，隨著配合物濃度的增大，CT-DNA粘度略有增加，說明配合物以插入方式與CT-DNA作用，但比典型的插入劑EB要弱。在配合物中的鄰菲咯啉等部分配體的共面性較大，會以插入方式進入到CT-DNA的堿基對中，造成堿基對之間的距離增大使DNA的雙螺旋伸長，導(dǎo)致溶液粘度增加。這與光譜法得出的結(jié)論一致。

圖6 配合物對CT-DNA相對粘度的影響Fig.6 Effects of the complex and EB on the relative viscosity of CT-DNA

2.2.5 瓊脂糖凝膠電泳法

以瓊脂糖為凝膠的電泳技術(shù)已被用于幫助了解小分子金屬配合物對DNA的切割作用機理[27]。質(zhì)粒DNA存在3種構(gòu)型：共價閉環(huán)的超螺旋(FormⅠ)的結(jié)構(gòu)最為緊密，遷移率最大；線型(FormⅢ)其次；而開環(huán)缺刻型(FormⅡ)由于結(jié)構(gòu)比較松散，遷移率最小。圖7為配合物切割pBR322 DNA的電泳圖，由圖 7 可見，當(dāng)配合物濃度為 60 μmol·L-1，質(zhì)粒DNA中出現(xiàn)了開環(huán)缺刻FormⅡ型。并且隨著配合物濃度的增大，超螺旋FormⅠ型越來越少，開環(huán)缺刻 FormⅡ型逐漸增多。當(dāng)濃度達到150 μmol·L-1時，超螺旋FormⅠ型完全消失。說明配合物對質(zhì)粒DNA具有一定的切割活性。

圖7 配合物切割pBR322 DNA的電泳圖Fig.7 Submarine gel electrophoresis of pBR322 DNA in the presence of the complex

3 結(jié) 論

合成了L-苯丙氨酸萘酚醛希夫堿鄰菲咯啉三元氧釩配合物，利用元素分析和IR進行了表征并測定了其晶體結(jié)構(gòu)。通過紫外吸收光譜、熒光光譜、圓二色光譜和粘度測量等研究了配合物與CT-DNA的相互作用，結(jié)果表明配合物以插入方式與CTDNA作用。利用瓊脂糖凝膠電泳初步研究了配合物對pBR322 DNA的切割作用，結(jié)果表明配合物可切割超螺旋型DNA為缺刻型DNA。

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Synthesis,Crystal Structure and DNA-Binding Studies of an Oxovanadium髧Complex[VO(Naph-Phe)(Phen)]with Mixed-Ligands

BIAN Lin LI Lian-Zhi＊WANG Xia HUANG LeiPU Xue-WeiDONG Jian-Fang
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Liaocheng University,Liaocheng,Shandong 252059,China)

A new oxovanadium complex with mixed-ligands of a Schiff base(Naph-Phe)derived from L-phenylalanine and 2-hydroxy-1-naphthaldehyde and 1,10-phenanthroline(Phen),[VO(Naph-Phe)(Phen)],has been synthesized and characterized by elementary analysis,IR and single crystal X-ray diffraction.It was shown that the complex crystallized in monoclinic crystal system,P21/c space group with the cell parameters:a=1.02785(11)nm,b=2.186 5(3)nm,c=1.171 150(13)nm,β=94.747 0(10)°,V=2.622 9(4)nm3,Z=4,F(000)=1 164,R1=0.076 7,wR2=0.165 5,S=1.092.The DNA-binding properties have been investigated by UV absorption,fluorescence,CD spectra and viscosity measurement.The results indicate that the complex binds to CT-DNA in an intercalative mode.Meanwhile,the cleavage reaction on plasmid DNA has been monitored by submarine gel electrophoresis.The complex could cleave circular plasmid pBR322 DNA to nicked form.CCDC:770157.

vanadium complex;Schiff base;crystal structure;DNA

O614.51+1

：A

：1001-4861(2011)04-0649-06

2010-09-21。收修改稿日期：2010-12-03。

山東省自然科學(xué)基金(No.Y2004B02)資助項目。

＊通訊聯(lián)系人。 E-mail：lilianzhi1963@163.com