梁曜華 畢 葳 梁國(guó)剛＊,

(1澳門(mén)藥物及健康應(yīng)用研究所，澳門(mén)科技大學(xué)，澳門(mén))(2中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

含吡啶的抗腫瘤轉(zhuǎn)移NAMI-A衍生物的制備和水解機(jī)理動(dòng)力學(xué)

梁曜華1,2畢 葳2梁國(guó)剛＊,1,2

(1澳門(mén)藥物及健康應(yīng)用研究所，澳門(mén)科技大學(xué)，澳門(mén))(2中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

目的 研究配體結(jié)構(gòu)對(duì)NAMI-A衍生物水解機(jī)理、電化學(xué)性質(zhì)的影響。方法 制備了trans-[RuCl4(DMSO)(3-MePy)][(3-MePy)H](3-MePy=3-甲基吡啶，化合物 1)和 trans-[RuCl4(DMSO)(4-MePy)][(4-MePy)H](4-MePy=4-甲基吡啶，化合物 2)。用 UV、NMR、CV 法研究化合物1、化合物2的水解機(jī)理-動(dòng)力學(xué)、溶液穩(wěn)定性及電化學(xué)性質(zhì)。結(jié)果 化合物1和化合物2與NAMI-A相似，在pH 7.40的緩沖液中發(fā)生脫氯水解反應(yīng)(Ⅰ氯水解及Ⅱ氯水解)(分步反應(yīng))；在pH 5.00緩沖液中DMSO(二甲亞砜)及少量吡啶水解。測(cè)定各水解反應(yīng)表觀速率常數(shù)及半衰期、溶液穩(wěn)定性及氧化還原電位。結(jié)論 化合物1、化合物2的Ⅰ氯、Ⅱ氯及DMSO水解反應(yīng)機(jī)理與NAMI-A相似，而且各水解速率與NAMI-A相差不大，即用甲基吡啶取代咪唑環(huán)，對(duì)NAMI-A衍生物的Ⅰ氯、Ⅱ氯及DMSO水解反應(yīng)速率影響較小?；衔镌谒嵝匀芤褐械姆€(wěn)定性明顯高于中性溶液。

釕配合物；抗腫瘤轉(zhuǎn)移；水解動(dòng)力學(xué)；穩(wěn)定性

0 引 言

順鉑(cisplatin)是當(dāng)前仍廣泛應(yīng)用于臨床的抗腫瘤藥。其抗癌藥效顯著，但毒副作用和耐藥性較強(qiáng)，且不能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。發(fā)現(xiàn)毒副作用小的抗腫瘤轉(zhuǎn)移化合物一直是研發(fā)抗腫瘤藥物的重要目標(biāo)。NAMI-A，[H2Im][trans-RuCl4(DMSO)HIm]對(duì)小鼠肺癌、乳腺癌的抗轉(zhuǎn)移作用明顯、毒性小[1-4]。其已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)[5]并進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)[6]。

順鉑水解后才有抗癌活性?？ㄣK(carboplatin)的水解速率比順鉑慢，因此毒性比順鉑低[7]。與順鉑相似，NAMI-A本身無(wú)藥效，其在pH＞7.0的溶液中的脫氯水解產(chǎn)物被認(rèn)為是抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的活性成分[8-10]。 但在 pH＜6.50 的溶液中，NAMI-A 分子中以DMSO水解為主，且隨pH降低DMSO的水解程度增大[3,8,11-12]。近來(lái)也有用不同化學(xué)計(jì)算的方法預(yù)測(cè)NAMI-A水解反應(yīng)的多篇文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]，驗(yàn)證了脫氯、脫DMSO的水解過(guò)程。Sava等曾用HPLC法研究了 NAMI-A 的Ⅰ氯水解反應(yīng)(pH 7.40，20～23 ℃)，但測(cè)定誤差較大[2]。Reedijk等用NMR測(cè)定了NAMI-A的Ⅰ氯和DMSO水解反應(yīng)，但未得到相應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)[8]。雖然Ⅱ氯水解產(chǎn)物的抗轉(zhuǎn)移活性大于Ⅰ氯水解產(chǎn)物[10]，但因?yàn)镹AMI-A衍生物Ⅱ氯水解過(guò)程較復(fù)雜而難于準(zhǔn)確測(cè)定[16]。

NAMI-A在生物體內(nèi)可能轉(zhuǎn)化為更利于與靶分子結(jié)合的Ru(Ⅱ)[17]，腫瘤內(nèi)環(huán)境(缺氧)[18]有利于此類還原反應(yīng)發(fā)生[19-21]。因此NAMI-A水解產(chǎn)物的氧化-還原電位可能影響藥效。

用適當(dāng)配體取代NAMI-A中的咪唑環(huán)不但影響NAMI-A的水解、電化學(xué)性質(zhì)，而且影響其抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥效和毒性[3-4,12]。Sava等曾在專利中制備過(guò)含有吡啶的NAMI-A衍生物[22]，并證明含甲基吡啶的NAMI衍生物(鈉鹽)有抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥效，但未指明甲基在苯環(huán)中的位置[23]。目前未見(jiàn)含吡啶的NAMI-A衍生物水解動(dòng)力學(xué)、電化學(xué)測(cè)定報(bào)道。本文制備了含有 3-MePy、4-MePy的 NAMI-A衍生物，測(cè)定了兩化合物在pH 7.40(模擬人體血液環(huán)境)和pH 5.00緩沖液(腫瘤細(xì)胞內(nèi)為酸性環(huán)境[24-25])中的水解機(jī)理和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、電化學(xué)性質(zhì)及溶液穩(wěn)定性，并與NAMI-A及其衍生物在相同條件下的測(cè)定數(shù)據(jù)比較，以探討配體結(jié)構(gòu)對(duì)NAMI-A衍生物水解機(jī)理、電化學(xué)性質(zhì)的影響，并初步預(yù)測(cè)其藥理活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

RuCl3·XH2O(水合三氯化釕)(Aldrich，purum，Ru～41%)；3-甲基吡啶(Merck，+98%)；4-甲基吡啶(上?；瘜W(xué)試劑有限公司，＞98.5%)；NaH2PO4.H2O(International Lab USA)；其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。trans-[RuCl4(DMSO)2][(DMSO)2H][26]、NAMIA[22]及 trans-[RuCl4(DMSO)(2-MeIm)][2-MeImH][27]按文獻(xiàn)方法制備。緩沖溶液制備：(a)磷酸緩沖溶液：分別用 0.15 mol·L-1NaCl配 制 0.1 mol·L-1NaH2PO4和0.5 mol·L-1NaOH 溶液， 并用 0.5 mol·L-1NaOH 溶液調(diào)節(jié) NaH2PO4溶液至 pH=7.40±0.02。 (b)醋酸緩沖溶液： 分別用 0.15 mol·L-1NaCl配制 0.2 mol·L-1醋酸鈉和 0.2 mol·L-1醋酸溶液，并用 0.2 mol·L-1醋酸溶液調(diào)節(jié)醋酸鈉溶液至 pH=5.00±0.02。

Bruker WYS-300型核磁共振儀，測(cè)定溶劑(CD3)2SO，TMS內(nèi)標(biāo)；美國(guó) Beckman Co.DU 800 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (電子控溫±0.1 ℃)；Φ 350 pH/Temp/mV meter pH計(jì)；Carbo-ERBA-1106型元素分析儀；Perkin Elmer spectrum BXⅡ紅外光譜測(cè)定儀(KBr壓片)；Stuart SMP10熔點(diǎn)測(cè)定儀。LK98BⅡ微機(jī)電化學(xué)分析系統(tǒng)。動(dòng)力學(xué)及電化學(xué)數(shù)據(jù)至少測(cè)定2次結(jié)果取均值。

1.1 化合物1的制備

將 trans-[RuCl4(DMSO)2][(DMSO)2H]0.15 g(0.27 mmol)溶于 8 mL 丙酮，加入 3-甲基吡啶 0.10 mL(1.1 mmol)后，超聲振蕩1.5 h。生成的桔黃色沉淀過(guò)濾，分別用丙酮(1 mL×6)和乙醚(1 mL×3)洗滌，硅膠干燥過(guò)夜。 產(chǎn)率：75%。M.P.：176～179 ℃。 Mw=508.28。Anal.Calcd.for C14H21N2Cl4ORuS(%)：H 4.16，C 33.08，N 5.51；Found(%)：H 3.94，C 33.18，N 5.37。UV-Vis(25 ℃，H2O)λmax，nm(ε，L·mol-1·cm-1)：286(3 320)，394(4 026)，457(500)。 IR(4 000～400 cm-1)(ν，cm-1)：3 163(s)，3 120(s)，3 071(s)，1 631，1 579，1 545，1184(s)，1106(vs)，459(s)，422(s)。ESI-MS(negative)，m/z 416[RuCl4(DMSO)(3-MePy)]-，322[RuCl4(DMSO)]-，244[RuCl4]-；ESI-MS(positive)，m/z 95[3-MePy]H+。1H NMR(DMSO-d6，δ)：8.81(3-MePyH+，H6 or H2，s)，8.47(3-MePyH+，H4，s)，8.00(3-MePyH+，H5，s)，-0.07(3-MePy-Ru， CH3′H， s)，-2.41(3-MePy-Ru， H2， s)，-12.84(DMSO，CH3′S，s)。

1.2 化合物2的制備

將 trans-[RuCl4(DMSO)2][(DMSO)2H]0.17 g(0.31 mmol)溶于8 mL丙酮，加入4-甲基吡啶0.12 mL(1.24 mmol)后，超聲振蕩 1.5 h。 生成的桔黃色沉淀過(guò)濾，用丙酮(1 mL×6)和乙醚(1 mL×3)洗滌，硅膠干燥過(guò)夜。 產(chǎn)率：82%。 M.P.：200～202 ℃。 Mw=508.28。Anal.Calcd.for C14H21N2Cl4ORuS(%)：H 4.16,C 33.08,N 5.51；Found(%)：H 3.98，C 33.26，N 5.38。 UV-Vis(25 ℃,H2O)，λmax，nm(ε，L·mol-1·cm-1)：280(3230)，393(3 880)，457(470)。 IR(4 000～400 cm-1)(ν，cm-1)：3 223(s)，3 059(vs)，1 637，1 611，1 504，1 199，1 083，426。ESI-MS(negative)，m/z 415.9[RuCl4(DMSO)(4-MePy)]-，322[RuCl4(DMSO)]-，244[RuCl4]-；ESI-MS(positive)，m/z 94.8[4-MePyH]+。1H NMR(DMSO-d6,δ):8.80(4-MePyH+,H2 and H6，s)，7.96(4-MePyH+，H3 and H5，s)，-2.00(4-Mepy-Ru，H2and H6，s)，-2.96(4-MePy-Ru，CH3′H，s)，-12.90(DMSO，CH3′S，s)。

Scheme 1 trans-[RuCl4(DMSO)(3-MePy)][(3-MePy)H](1)及trans-[RuCl4(DMSO)(4-MePy)][(4-MePy)H](2)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Scheme 1 Chemical structures of trans-[RuCl4(DMSO)(3-MePy)][(3-MePy)H](1)and trans-[RuCl4(DMSO)(4-MePy)][(4-MePy)H](2)

1.3 化合物水解反應(yīng)機(jī)理的研究

研究表明NAMI-A在pH 7.40緩沖液中發(fā)生分步脫氯水解反應(yīng)[28]，即Ⅰ氯水解(Abs(389 nm)下降，Abs(340 nm)上升)及Ⅱ氯水解(Abs(340 nm)下降。在生理鹽水中發(fā)生脫DMSO水解反應(yīng)(Abs(389 nm)下降[29]。我們分別測(cè)定化合物在磷酸緩沖溶液(pH 7.40)及生理鹽水溶液(pH 5～6)中的紫外吸收光譜，結(jié)果與NAMI-A的相應(yīng)圖譜相似見(jiàn)圖1、4。

1.4 化合物的水解動(dòng)力學(xué)研究

為將測(cè)定的吸光度轉(zhuǎn)化為濃度，按文獻(xiàn)[30]方法分別在化合物或其水解產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(n=3，r＞0.999)。

將化合物溶于緩沖或非緩沖液，立即選擇最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。得到的吸光度-時(shí)間曲線：對(duì)零級(jí)反應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程轉(zhuǎn)化成濃度-時(shí)間曲線按零級(jí)反應(yīng)方程 (C=B+Kobst其中C為反應(yīng)濃度；B為擬合常數(shù)；Kobs為表觀速率常數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間)擬合；對(duì)一級(jí)反應(yīng)則將吸光度轉(zhuǎn)化成百分吸光度按一級(jí)反應(yīng)方程(Ar=C0+C1exp(-kobst)其中Ar為百分吸光度；C0、C1為擬合常數(shù)；Kobs為表觀速率常數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間)擬合。擬合范圍約為反應(yīng)的10%～90%，r＞0.99。動(dòng)力學(xué)反應(yīng)測(cè)定為至少重復(fù)兩次后取均值。

1.5 化合物的電化學(xué)研究

電化學(xué)測(cè)定使用LK98BII微機(jī)電化學(xué)分析系統(tǒng)。碳電極(Φ3)為工作電極，鉑電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極。以氯化鈉為支持電解質(zhì)，掃描速度 0.1 V·s-1。

1.6 1H NMR反應(yīng)機(jī)理研究

使用VNS-600型核磁共振儀，測(cè)定溶劑D2O，以 3-三甲基甲硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸鈉(TSP)為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定溫度50℃，時(shí)間間隔為25 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)參數(shù)

化合物1、化合物2及NAMI-A衍生物(包括各水解產(chǎn)物)的紫外、紅外光譜數(shù)據(jù)列于表1、表2。表1中2個(gè)化合物的紫外、紅外光譜數(shù)據(jù)與NAMI-A衍生物差別不大[22]，表明將NAMI-A的咪唑環(huán)換成吡啶環(huán)，對(duì)其結(jié)構(gòu)參數(shù)影響較小。表2中化合物1、2的Ⅰ氯、Ⅱ氯水解產(chǎn)物的吸收與NAMI-A的相應(yīng)水解產(chǎn)物相近，說(shuō)明化合物1、2與NAMI-A的脫氯水解反應(yīng)機(jī)理相近[10](見(jiàn)scheme 2)。

2.2 化合物1及化合物2在pH 7.40緩沖液中的水解機(jī)理及動(dòng)力學(xué)研究

圖1為化合物1在pH 7.40緩沖液中水解反應(yīng)的紫外光譜。

化合物2的水解機(jī)理與化合物1非常相近 (圖略)。Ⅰ氯水解反應(yīng)(Abs(393 nm)下降，Abs(346 nm)上升)，拐點(diǎn)367 nm；Ⅱ氯水解反應(yīng)(Abs(346 nm)下降，Abs(300 nm)上升)，拐點(diǎn) 270、335 和 438 nm。 相應(yīng)脫氯水解反應(yīng)的速度也差別不大。顯然，兩個(gè)化合物與NAMI-A的脫氯水解反應(yīng)相同，同為明顯的分步水解反應(yīng)[8,10,13-14]。在磷酸鹽緩沖液中Ⅱ氯水解反應(yīng)數(shù)據(jù)擬合見(jiàn)圖2，測(cè)定的脫氯水解反應(yīng)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表 1 trans-[RuCl4(DMSO)(L)][HL](L=3-MePy，4-MePy，Im，N-EtIm，2-MeIm)的紅外及紫外光譜Table 1 Infrared and UV spectra of trans-[RuCl4(DMSO)(L)][HL](L=3-MePy,4-MePy,Im,N-EtIm,2-MeIm)

表 2 NAMI-A 衍生物及其水解產(chǎn)物的紫外光譜(λmax)(pH 7.40，0.15 mol·L-1NaCl，37 ℃)Table 2 UV absorptions(λmax)of NAMI-A derivatives together with their degradation products(pH 7.40,0.15 mol·L-1NaCl,37 ℃)

Scheme 2 化合物1、化合物2及NAMI-A在pH 7.40磷酸鹽緩沖溶液中的水解過(guò)程Scheme 2 Proposed degradation of Compd.1,Compd.2 and NAMI-A in phosphate buffer saline(pH 7.40)

Reedijk等用NMR測(cè)定NAMI-A的Ⅰ氯水解、DMSO水解反應(yīng)時(shí)由于曲線擬合不好無(wú)法得到動(dòng)力學(xué)參數(shù)[8]。Sava等用HPLC測(cè)定了NAMI-A的Ⅰ氯水解反應(yīng)(20～23℃)，但測(cè)定時(shí)需隨時(shí)加適量酸、堿以維持樣品溶液pH值不變；此外分離條件也對(duì)測(cè)定精度有較大影響[2]。本文用UV-Vis直接測(cè)定化合物1的Ⅰ氯、Ⅱ氯水解及DMSO水解反應(yīng)，影響反應(yīng)精度因素較少 (溫度變化±0.1℃，pH值變化±0.02)，方法簡(jiǎn)單。化合物1的紫外光譜變化(圖2)及水解機(jī)理與NAMI-A基本一致(已得到NMR譜證明)[8,10]?；衔?水解明顯分為Ⅰ氯水解和Ⅱ氯水解反應(yīng)。Ⅰ氯水解(393 nm吸收下降，346 nm上升)反應(yīng)中，367 nm處的拐點(diǎn)表明溶液中存在[trans-RuCl4(DMSO)(3-MePy)]-與[RuCl3(DMSO)(3-MePy)(H2O)]的化學(xué)平衡，約14 min后此過(guò)程結(jié)束。346 nm吸收由升轉(zhuǎn)降，300 nm吸收上升。336、391、442 nm處拐點(diǎn)表明溶液中 [RuCl3(DMSO)(3-MePy)(H2O)]和[RuCl2(DMSO)(3-MePy)(H2O)2]+的化學(xué)平衡，即Ⅱ氯水解反應(yīng)[10]。該反應(yīng)約22 min后結(jié)束。計(jì)算的化合物1、化合物2的Ⅰ氯、Ⅱ氯水解及脫DMSO水解反應(yīng)的t1/2與圖中的反應(yīng)時(shí)間基本相符。

圖1 化合物1(0.30 mmol·L-1)在磷酸緩沖溶液(pH 7.40，0.15 mol·L-1NaCl，37℃)中的水解反應(yīng)(時(shí)間間隔1 min)Fig.1 Degradation of Compd.1(0.30 mmol·L-1)in phosphate buffer saline(pH 7.40,0.15 mol·L-1NaCl,37 ℃)recorded every 1 min by UV spectrophotometer

圖2 化合物1和化合物2(0.30 mmol·L-1)在磷酸緩沖液(pH 7.40，0.15 mol·L-1NaCl，37 ℃)中的Ⅱ氯水解反應(yīng)和擬合曲線Fig.2 2ndchloro-hydrolysis of Compd.1 and Compd.2(0.30 mmol·L-1)in phosphate buffer saline(pH 7.40,0.15 mol·L-1NaCl,37 ℃)monitored by plotting C vs t and fitted lines

2.3 化合物1及化合物2在pH 5.00緩沖液中的水解動(dòng)機(jī)理及動(dòng)力學(xué)研究

與NAMI-A相同,化合物1、2在醋酸緩沖液 (pH 5.00)中表現(xiàn)為393 nm(λmax)吸收峰下降，此反應(yīng)可歸結(jié)為脫DMSO反應(yīng)[8]。反應(yīng)曲線擬合情況見(jiàn)圖3。

圖3中線a為化合物1脫DMSO水解反應(yīng)。擬合得直線方程(3)：

圖3 化合物1(a)及化合物2(b)(0.30 mmol·L-1)在醋酸緩沖液(pH 5.00，0.15 mol·L-1NaCl，37 ℃)中的脫DMSO水解曲線及擬合曲線Fig.3 DMSO hydrolytic procedure of Compd.1(a)and Compd.2(b)(0.30 mmol·L-1)in acetic buffer solution(pH 5.00,0.15 mol·L-1NaCl,37 ℃);Straight lines were resulted by plotting C vs t and fitted

表 3 化合物 trans-[RuCl4(DMSO)L][LH](L=3-MePy，4-MePy，Im and 2-MeIm)在緩沖液中(pH 5.00/7.40，0.15 mol·L-1NaCl，37 ℃)或生理鹽水(pH 5～6，0.15 mol·L-1NaCl，50 ℃)中的水解速率常數(shù)及半衰期的比較Table 3 Comparison on hydrolytic rate and half-life time of trans-[RuCl4(DMSO)L][LH](L=3-MePy,4-MePy,Im and 2-MeIm)in buffer solution(pH 5.00/7.40,0.15 mol·L-1NaCl,37 ℃)or physiological saline(pH 5～6,0.15 mol·L-1NaCl,50 ℃)

由方程3得：

同法測(cè)得化合物2的脫DMSO水解反應(yīng)(圖 3b)：

Kobs=1.510×10-6L·mol-1·min-1，t1/2=99.34 min

2.4 化合物的穩(wěn)定性

NAMI-A衍生物的溶液穩(wěn)定性是影響藥效的重要因素[11,31]。圖4為2個(gè)化合物在生理鹽水中的紫外吸收光譜。由于溶液的pH為5～6，水解反應(yīng)主要為脫DMSO水解，但氫譜證明同時(shí)伴隨發(fā)生堿基水解，因此計(jì)算得到的是總表觀速率常數(shù)(Scheme 3)，數(shù)據(jù)擬合見(jiàn)圖5。依本法測(cè)定NAMI-A衍生物的溶液穩(wěn)定性精度較高，且簡(jiǎn)便[2,32]。

圖4 化合物 1 和化合物 2(0.30 mmol·L-1)在生理鹽水溶液(pH 5～6，0.15 mol·L-1NaCl，50 ℃)中的水解反應(yīng)(Abs(393 nm)下降，Abs(320 nm)上升)Fig.4 Aquated procedure of Compd.1 and Compd.2(0.30 mmol·L-1)in physiological solution(pH 5～6,0.15 mol·L-1NaCl,50 ℃)measured at 5 min interval.The absorptions changed by decreasing at 393 nm and increasing at 320 nm

圖5a為化合物1在生理鹽水溶液中的水解反應(yīng)(測(cè)定波長(zhǎng)為393 nm)。以指數(shù)衰減一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型擬合得曲線方程：

由方程4得：

同法測(cè)定了化合物2(圖5b)、trans-[RuCl4(DMSO)(2-MeIm)][(2-MeIm)H](圖 5c) 及 NAMI-A(圖 5d)在生理鹽水溶液中的穩(wěn)定性，以一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型經(jīng)非線性擬合得到各表觀速率常數(shù)及半衰期(表 3)。

Scheme 2表示化合物1，化合物2及NAMI-A在pH 7.40緩沖液中的水解反應(yīng)過(guò)程及水解產(chǎn)物，其中B、C為主要藥效分子，在抗腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理中起重要作用[8-9]。

圖5 化合物 1(a)、2(b)、trans-[RuCl4(DMSO)(2-MeIm)][2-MeImH](c)和 NAMI-A(d)(0.30 mmol·L-1)在生理鹽水溶液(pH 5～6，0.15 mol·L-1NaCl，50 ℃)中的穩(wěn)定性及擬合曲線Fig.5 Stabilities of Compd.1(a),Compd.2(b),trans-[RuCl4(DMSO)(2-MeIm)][2-MeImH](c)and NAMI-A(d)(0.30 mmol·L-1)in physiological saline(pH 5～6,0.15 mol·L-1NaCl,50 ℃)and fitted lines

表3中化合物1，2的脫氯、脫DMSO水解速率與NAMI-A相差不多，但將推電子甲基引入NAMIA的咪唑環(huán)的2位明顯加快脫氯、脫DMSO反應(yīng)速率，且對(duì)溶液穩(wěn)定性影響明顯。 而將甲基吡啶環(huán)替換咪唑環(huán)后對(duì)化合物的水解反應(yīng)及穩(wěn)定性影響不大。化合物2(4-Mepy)的溶液穩(wěn)定性較化合物1和NAMI-A稍差?；衔锶芤涸谒嵝詶l件下更穩(wěn)定。

2.5 電化學(xué)研究

電化學(xué)測(cè)定(圖6)數(shù)據(jù)列于表4。兩化合物的氧化、還原電位幾乎相同；化合物溶液在60 min后的氧化、還原電位變化可歸結(jié)為水解反應(yīng)(由氫譜可證明)。

圖6 化合物 1(左)及化合物 2(右)(0.50 mmol.L-1)在水溶液(0.15 mol·L-1NaCl，37 ℃)中的循環(huán)伏安圖。初始循環(huán)伏安曲線(實(shí)線)，60 min后循環(huán)伏安曲線(虛線)Fig.6 Cyclic voltammograms of Compd.1(left)and Compd.2(right)(0.50 mmol·L-1)in(0.15 mol·L-1NaCl,37 ℃).Scanned after 0 min(curve),60 min(…)

表 4 化合物 1、化合物 2與 NAMI-A(0.50 mmol·L-1)在生理鹽水溶液(0.15 mol·L-1NaCl，50℃)中的氧化電位、還原電位及標(biāo)準(zhǔn)電位Table 4 Oxidation,reduction and formal electrode potential of Compd.1,Compd.2 and NAMI-A(0.50 mmol·L-1)in physiological saline(0.15 mol·L-1NaCl)at 50 ℃

2.6 核磁測(cè)定

化合物1的核磁測(cè)定圖譜見(jiàn)圖7?；衔?的氫譜與化合物1相似(圖略)。2個(gè)化合物的核磁譜相對(duì)峰面積隨水解時(shí)間的變化見(jiàn)圖8。

圖8中，游離DMSO濃度隨時(shí)間上升，配位DMSO濃度下降；游離堿基的濃度上升，配位堿基的濃度下降，表明化合物在D2O中不僅DMSO水解，堿基也明顯水解。2個(gè)化合物的堿基水解程度不同?；衔?的堿基配體水解速率比化合物1略快，其脫DMSO水解速率也比化合物1快。因此總反應(yīng)速率化合物2＞化合物1，與表3中2個(gè)化合物的溶液穩(wěn)定性順序相符。因?yàn)槊揇MSO水解和脫堿基水解都影響藥效，準(zhǔn)確測(cè)定各水解反應(yīng)有助于初步預(yù)測(cè)其抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥效。

圖7 化合物1在50℃,D2O中的1H NMR圖譜Fig.7 Stack plot of the1H NMR spectra of Compd.1 inD2O recorded in 0～75 min interval at 50 ℃

圖8 化合物1(左圖)，化合物2(右圖)水解的600 MHZ氫核磁譜(D2O，50℃)Fig.8 600 MHZ1H NMR spectra of hydrolysis of Compd.1(left)and Compd.2(right)in D2O recorded at 50 ℃

3 結(jié) 論

化合物1、化合物2與NAMI-A在生理鹽水溶液中的氧化還原電位相差不大，兩個(gè)化合物的水解產(chǎn)物的電位也基本未見(jiàn)明顯差異，見(jiàn)表4及圖6。

NAMI-A的Ⅰ氯、Ⅱ氯水解產(chǎn)物在體外能與模擬靶點(diǎn)蛋白配位結(jié)合[9-10]；其脫DMSO的水解產(chǎn)物(腫瘤組織的低pH環(huán)境)能與模擬靶點(diǎn)DNA分子結(jié)合[8]?；衔?和化合物2的脫氯、脫DMSO水解機(jī)理與NAMI-A相似。研究NAMI-A衍生物的體外作用機(jī)理，比較衍生物的Ⅰ氯、Ⅱ氯水解、及DMSO水解反應(yīng)機(jī)理、速率、半衰期，即各活性中間產(chǎn)物在生理溶液中的存在狀態(tài)、時(shí)間是預(yù)測(cè)化合物的穩(wěn)定性及藥效的重要依據(jù)。相同條件下NAMI-A的Ⅰ氯、Ⅱ氯水解反應(yīng)半衰期(t1/2)與化合物1、2的相應(yīng)水解反應(yīng)速率相差不大(表3)，表明用甲基吡啶環(huán)取代咪唑環(huán)，對(duì)NAMI-A衍生物的Ⅰ氯、Ⅱ氯水解反應(yīng)速率影響較小，但在咪唑環(huán)的2位引入推電子基則明顯加速化合物的Ⅰ氯、Ⅱ氯及DMSO水解反應(yīng)速率?；衔?、2在酸性溶液中的穩(wěn)定性明顯高于中性溶液。預(yù)計(jì)化合物1、2有與NAMI-A相似的抗肺癌或乳腺癌轉(zhuǎn)移作用。

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Preparation and Mechanism-Kinetics of Antimetastasis of NAMI-A Derivatives Containing Pyridine

LIANG Yao-Hua1,2BI Wei2LIANG Guo-Gang＊,1,2
(1Macau Institute for Applied Research in Medicine and Health,Macau University of Science and Technology,Macau,China)(2Institute of Chinese Material Medica,China Academy of Chinese Medical Science,Beijing 100700,China)

Objective To study the influence of ligand structure on the hydrolysis rate of anti-metastasis NAMI-A derivatives trans-[RuCl4(DMSO)(3-MePy)][(3-MePy)H](3-MePy=3-methypyridine,Compd.1)and trans-[RuCl4(DMSO)(4-MePy)][(4-MePy)H](4-MePy=4-methypyridine,Compd.2).Method Hydrolytic mechanism,kinetics,stability and electrochemistry of Compd.1 and Compd.2 were studied by UV-Vis,NMR and CV.Result The complexes undergo two well-separated steps of chloride hydrolysis at pH 7.40;while dimethyl sulfoxide(DMSO)hydrolyzed in pH 5.00 buffer solution.The Kobsand t1/2for each reaction were determined.Conclusion Very similar to NAMI-A,the compounds loses 1stand 2ndchloride in two separated steps at pH 7.40;and loses DMSO in pH 5.00 buffer solution.The hydrolytic rate of the compounds including two chlorides and DMSO hydrolysis were similar to that of NAMI-A,which demonstrated that the influence of replacing imidazole by methyl pyridine on the hydrolysis rate of NAMI-A derivatives is not remarkable.The stability of the compounds in acidic solution is much more stable than that of in neutral solution.

ruthenium complexes;anti-metastasis;hydrolytic kinetics;stabilities

O614.82+1

：A

：1001-4861(2011)04-0595-09

2010-09-06。收修改稿日期：2010-11-07。

澳門(mén)科技發(fā)展基金(No.012/2009/A1)、國(guó)家科技部國(guó)際合作基金(No.2005DFA30990)和中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)自主選題項(xiàng)目(No.ZZ2006120，Z02089)資助。

＊通訊聯(lián)系人。 E-mail：Lguogang200@126.com；Tel：+0086-010-84033375