翟玉華,梁玉芳,陳文明,王清濤

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京100020;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院血液科)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種好發(fā)于中老年的單克隆漿細(xì)胞異常增生的惡性疾病。其發(fā)病率隨年齡增長而增加?？寺⌒詽{細(xì)胞病患者血清及尿中常出現(xiàn)游離輕鏈。其分子量小,合成速度略快于重鏈。在與重鏈結(jié)合后有部分輕鏈游離于血中,正常人維持在低濃度水平,而在多發(fā)性骨髓瘤時(shí)游離輕鏈大量增加。實(shí)驗(yàn)室常以本周氏蛋白陽性與否來判斷是否有游離輕鏈。而本周氏蛋白(尿中游離輕鏈)檢測受多種因素的影響[1](如患者的腎臟功能及尿量),而血清游離輕鏈在判斷患者病情、監(jiān)測療效等方面優(yōu)于尿輕鏈。該檢測在國外已較廣泛地應(yīng)用于漿細(xì)胞增殖性的診斷和監(jiān)測中,其檢測的靈敏度高,特異強(qiáng)[2-4]。本實(shí)驗(yàn)室將以骨髓瘤患者為對(duì)象,評(píng)價(jià)幾種常用檢測方法,在診斷、療效觀察及預(yù)后判斷中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 樣本 MM患者標(biāo)本完整免疫球蛋白型29例(包括IgG、IgA 、IgD 型),輕鏈型21例,來自2006年6月-2008年11月我院及外院門診及住院送檢標(biāo)本,臨床明確診斷為多發(fā)性骨髓瘤患者均符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

美國BECKMAN公司1MMAGE雙光徑免疫分析儀和BECKMAN公司原裝免疫球蛋白及輕鏈檢測試劑;法國Sebia HYDRASYS全自動(dòng)電泳儀及原裝試劑,進(jìn)行血清蛋白電泳,免疫固定電泳檢測;英國Binding site公司Free Kap、Free Lam試劑。在美國BECKMAN公司 1MMAGE雙光徑免疫分析儀上檢測。

1.3 方法

1.3.1 采集患者空腹不抗凝靜脈血5 ml,2 500 r/min離心5分鐘分離血清。用以上試劑及儀器以速率散射比濁法定量檢測IgG、IgA、IgD及輕鏈Kappa、Lamda。

1.3.2 24小時(shí)尿標(biāo)本混勻記尿量,送檢10 ml。用以上試劑及儀器以速率散射比濁法定量檢測尿中輕鏈Kappa、Lamda。比值明顯異常且免疫固定電泳中與抗κ輕鏈或抗λ輕鏈血清形成致密濃染的沉淀帶為本周陽性。

1.3.3 血清蛋白電泳:取10 μ l血清標(biāo)本于加樣梳在瓊脂糖凝膠板上電泳,干燥,染色,脫色,烘干,掃描。在α 2-γ區(qū)可見單克隆區(qū)帶為M成份檢測陽性。

1.3.4 免疫固定電泳:血清標(biāo)本的M蛋白濃度預(yù)稀釋成1.5 g/l左右再進(jìn)行IFE,取已稀釋好10 μ l標(biāo)本于加樣梳在瓊脂糖凝膠板上電泳后,依次加入固定劑 、抗 IgG 、抗 IgA 、抗IgM 、抗IgD,抗 κ輕鏈,抗 λ輕鏈血清各10 μ l。孵育固定沉淀蛋白,再吸去多余的抗血清,烘干,染色,脫色,烘干,觀察結(jié)果。與抗體結(jié)合的免疫球蛋白將沉淀在凝膠中,其他蛋白可被洗去。再用酸性結(jié)晶紫或氨基黑染色后即可在凝膠上顯現(xiàn)出不同型的免疫球蛋白及其相對(duì)含量。若有單克隆成份的免疫球蛋白存在時(shí)會(huì)在某一抗血清的泳道上形成致密濃染的沉淀帶。

1.3.5 英國Binding site公司Free Kap、Free Lam試劑在BECKMAN公司1MMAGE雙光徑免疫分析儀上定量檢測(嚴(yán)格按說明書要求操作)。血清檢測結(jié)果判定參考區(qū)間:游離κ 8.9-25.5(mg/L)游離λ 12.5-33.6(mg/L)游離κ/λ0.49-1.07。游離κ/λ超出范圍為陽性[1]。

2 結(jié)果

50例標(biāo)本其中LCMM患者21例,IIMM患者29例(包括IgG、IgA及IgD型)?；颊邩?biāo)本做血清免疫固定電泳輕鏈檢測,尿輕鏈定量檢測及血清游離輕鏈檢測。對(duì)于21例LCMM患者,三種方法游離輕鏈陽性率分別為90.5%(19/21),80.9%(17/21),100%(21/21),對(duì)于29例IIMM患者游離輕鏈陽性率分別為 20.7%(6/29),41.4%(12/29),82.7%(24/29),見表1、表2、圖1。(注:免疫固定電泳法是用血清免疫固定試劑而非本周氏免疫固定試劑)。

3 討論

圖1 血尿蛋白電泳區(qū)帶,掃描圖及免疫固定電泳圖

表1 LCMM與IIMM血清IFE輕鏈檢測、尿本周蛋白檢測、血游離輕鏈檢測結(jié)果

表2 IIMM患者血清IFE輕鏈檢測、尿本周蛋白檢測、血游離輕鏈檢測結(jié)果

免疫球蛋白重鏈與輕鏈結(jié)合時(shí),輕鏈分子量小,其合成速度略快于重鏈,在與重鏈組裝成完整的免疫球蛋白分子后會(huì)有部分輕鏈游離于血液中,可自由通過腎小球?yàn)V過膜而被濾出。因此血清及尿中理論上都有少量的游離輕鏈(FLC,Free light chain)。以往的檢測方法缺乏針對(duì)游離輕鏈特異的單克隆抗體因此受檢測靈敏度限制低濃度游離輕鏈常常為陰性。目前檢測血清FLC采用針對(duì)輕鏈上隱藏位點(diǎn)的多克隆抗體,特異結(jié)合FLC,特異性及靈敏性高,可檢測低濃度的FLC。人類產(chǎn)κ輕鏈的漿細(xì)胞是產(chǎn)λ輕鏈的兩倍。一般情況下κ以單體、λ以二聚體形式存在,腎臟對(duì)κ以單體濾過速度大約是λ二聚體的三倍,因此盡管κ的產(chǎn)量較λ的多,但血清中λ的濃度高于κ。多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種起源于前B細(xì)胞的骨髓漿細(xì)胞惡性增殖性疾病。其表現(xiàn)為骨髓中存在大量惡性漿細(xì)胞,這些細(xì)胞分泌大量的單克隆免疫球蛋白(M-蛋白),過量分泌且發(fā)生組裝障礙,而出現(xiàn)重鏈和游離輕鏈大量并存的現(xiàn)象。

用檢測血清游離輕鏈方法檢測骨髓瘤患者伴隨輕鏈可高達(dá)90%。盡管血清免疫固定電泳酸性結(jié)晶紫染色對(duì)單克隆免疫球蛋白的檢出敏感性為25 mg/dl,能檢測出非常少的單克隆成份,但在重鏈型多發(fā)性骨髓瘤樣本中由于高濃度單克隆免疫球蛋白的存在做免疫固定電泳時(shí)加大稀釋倍數(shù),使得與重鏈相比濃度較低的游離輕鏈在稀釋過程中與抗輕鏈血清結(jié)合的濃度過低,又有相當(dāng)部分游離輕鏈排泄于尿中。因此在用血清免疫固定電泳法檢測時(shí)常常看不到游離輕鏈的沉淀帶,此方法的游離輕鏈陽性檢出率低。

約有40%的IgD型MM患者常出現(xiàn)在抗輕鏈的泳道上形成兩條單克隆成份,經(jīng)免疫固定電泳證實(shí)此兩條區(qū)帶,一條為與IgD結(jié)合的輕鏈,另一條為游離輕鏈。由于臨床上IgD型MM較其它型少,且正常人體內(nèi)IgD水平極低,即使IgD型MM患者血清中IgD成倍增長但總IgD水平仍偏低,相當(dāng)一部分患者在做血清免疫固定電泳時(shí)與其它完整型MM比較會(huì)減少稀釋倍數(shù)因此在IFE中可見有游離輕鏈致密條帶者可達(dá)40%。

輕鏈型骨髓瘤患者標(biāo)本在做免疫固定電泳中無與重鏈抗血清結(jié)合的條帶,而與某一型抗輕鏈血清結(jié)合形成致密條帶。由于小分子輕鏈生成,通過腎小球?yàn)V至尿內(nèi)出現(xiàn)本周蛋白。血清中輕鏈濃度往往不高在做血清免疫固定電泳時(shí)會(huì)減少稀釋倍數(shù)因此在IF中可見無與重鏈抗血清結(jié)合的條帶,而與某一型抗輕鏈血清結(jié)合形成致密條帶者可高達(dá)90%。

血清游離輕鏈檢測不存在上述做免疫固定電泳所需按重鏈濃度稀釋問題,并且為定量檢測,且游離κ和λ不受腎臟功能及尿量影響,有較好的特異性和靈敏性,在骨髓瘤伴隨輕鏈的檢測及懷疑病人有單克隆的FLC產(chǎn)生時(shí)應(yīng)首先用血清FLC定量檢測來提高疾病的檢出率,FLC在體內(nèi)的半衰期短,用于監(jiān)測治療,可及時(shí)判斷早期復(fù)發(fā)及微小殘留病[5,6],有很高的臨床實(shí)用價(jià)值。

目前血清免疫固定電泳法,在克隆性漿細(xì)胞病的免疫分型中,有不可取代的作用,結(jié)合血清游離輕鏈定量檢測對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者的明確診斷、療效觀察及改善預(yù)后起重要作用。

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