何建偉,李 靜,趙 濤,曹薇薇

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,新疆石河子832002;2.新疆農(nóng)九師額敏縣醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院2008級(jí)檢驗(yàn)本科班;4.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院民族高發(fā)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

抗核抗體(antinuclear antibody,ANA)主要用于自身免疫性疾病的篩查,而可提取性核抗原(extracted nuclear antigen antibody,ENA)抗體譜對(duì)于自身免疫性疾病的診斷、鑒別診斷及臨床治療有重要的幫助[1]。本研究是對(duì)本科室開(kāi)展的1084例ANA檢測(cè)結(jié)果和512例聯(lián)合檢測(cè)ANA、抗ENA抗體譜的結(jié)果進(jìn)行回顧性分析,探討ANA熒光核型與抗ENA抗體不同項(xiàng)目陽(yáng)性結(jié)果之間的相關(guān)性,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下:

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 自2009年6月至2011年4月在新疆石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的門診和住院病人,患者來(lái)自于新疆石河子地區(qū)包括市區(qū)及周邊農(nóng)牧團(tuán)場(chǎng)等漢族人群1 084例,均用非抗凝管真空采靜脈血分離血清。男女性別比是1∶3.27。年齡10-85歲,平均年齡46.9±17.9歲。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑 間接免疫熒光法檢測(cè)ANA,FITC標(biāo)記的IgG型鼠抗人抗體(Dako Denmark A/S)?？笶NA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)歐蒙公司。試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2.2 方法

①間接免疫熒光法檢測(cè)ANA 將血清與配置好的緩沖液進(jìn)行1∶100倍稀釋,取25 μ l血清與鼠肝組織印片室溫反應(yīng)30 min,沖洗反應(yīng)液后,緩沖液浸泡5 min后加熒光二抗,室溫反應(yīng)30 min,在重復(fù)洗滌浸泡,甘油封片,在熒光顯微鏡下閱片。

②抗ENA抗體譜的檢測(cè):每槽加入1 ml孵育液后加入待檢血清10 μ l,37℃振蕩孵育30 min后,稀釋液洗滌3次,每槽加入酶標(biāo)二抗1 ml,37℃振搖孵育30min,再同上洗滌,之后加入顯色底物1 ml振搖10 min,最后加入終止液1 ml終止反應(yīng),1 min后棄去液體結(jié)果判定。

1.3 儀器 間接免疫熒光法檢測(cè)ANA采用Olympus IX71型熒光顯微鏡(日本生產(chǎn))觀察熒光核型?？笶NA抗體譜檢測(cè)采用BY-80S脫色搖床(金壇市恒豐儀器廠)振搖。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 間接免疫熒光法檢測(cè)ANA判定標(biāo)準(zhǔn) 熒光顯微鏡下觀察鼠肝細(xì)胞熒光染色情況。無(wú)特異性熒光判為為陰性,產(chǎn)生明顯特異性熒光染色并可辨熒光模型則可判為陽(yáng)性。陽(yáng)性血清按1∶20、1∶40、1∶80、1∶160......滴度系統(tǒng)測(cè)得抗體最終滴度,滴度≥1∶40記為陽(yáng)性,同時(shí)報(bào)告熒光核型。ANA核型分類為核勻質(zhì)型,核斑點(diǎn)型、核周型和混合型(為便于分析,把前三種熒光核型以外的所有熒光核型歸為混合型)。

1.4.2 抗ENA抗體譜結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 反應(yīng)后的膜條與標(biāo)準(zhǔn)譜帶圖對(duì)照,相應(yīng)的譜帶定位和帶型出現(xiàn)著色后,可判定相應(yīng)抗體陽(yáng)性。ENA抗體檢測(cè)項(xiàng)目中有1項(xiàng)以上陽(yáng)性時(shí),就記為抗ENA抗體陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。ANA結(jié)果和抗ENA抗體結(jié)果的一致性用Kappa值計(jì)算分析。不同核型ANA標(biāo)本中抗ENA抗體陽(yáng)性率比較通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得到?？笶NA抗體中各項(xiàng)目與各種熒光核型的關(guān)系比較采用 χ2檢驗(yàn) 。

2 結(jié)果

2.1 ANA陽(yáng)性標(biāo)本與抗ENA抗體陽(yáng)性標(biāo)本吻合程度分析(見(jiàn)表1)

表1 ANA陽(yáng)性標(biāo)本與抗ENA抗體陽(yáng)性標(biāo)本吻合程度分析

本研究1084份樣本中僅512份樣本聯(lián)合檢測(cè)ANA和抗ENA抗體。Kappa值=0.249,說(shuō)明吻合程度很差。

2.2 ANA陽(yáng)性標(biāo)本的核型分析

512份臨床標(biāo)本聯(lián)合檢測(cè)ANA抗體和抗ENA抗體。ANA陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)為169例。其核型分布見(jiàn)表2。核型陽(yáng)性構(gòu)成比例最高的是核均質(zhì)型72.18%(122/169),其次是核斑點(diǎn)型18.34%(31/169)、核周型7.10%(12/169)、混合型2.37%(4/169)。

表2 不同核型ANA標(biāo)本中抗ENA抗體陽(yáng)性率比較

2.3 不同核型ANA標(biāo)本中抗ENA抗體陽(yáng)性率比較 見(jiàn)表2。

2.4 169例ANA陽(yáng)性標(biāo)本中抗ENA抗體與各種熒光核型之間的相關(guān)性分析(見(jiàn)表3)。

抗ds-DNA抗體在核周型ANA標(biāo)本中的陽(yáng)性率最高(χ2=24.095,P＜0.01),說(shuō)明抗ds-DNA抗體主要與核周型熒光核型相關(guān)?？筊o/SSA60抗體單項(xiàng)陽(yáng)性總例數(shù)最多,達(dá)到56例(33.1%),其核型分布比較分散,但主要表現(xiàn)為核均質(zhì)型與核斑點(diǎn)型,陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=38.637,P＜0.05)?？?Ro/SSA52、抗 La/SSB抗體基本上與抗R0/SSA60抗體同時(shí)出現(xiàn)。在各種核型ANA標(biāo)本中的陽(yáng)性率有差異(χ2=13.714,P＜0.02)?？箄lRNP抗體在斑點(diǎn)型ANA標(biāo)本中的陽(yáng)性率最高,均質(zhì)型次之,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.978,P＜0.05)?？筊ibosomal抗體在核周型ANA標(biāo)本中的陽(yáng)性率最高(41.7%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.502,P＜0.05)。Sm抗體在斑點(diǎn)型ANA標(biāo)本中的陽(yáng)性率最高(29%),在各種熒光核型中的陽(yáng)性率差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=28.993,P＜0.05),且抗Sm抗體主要與抗u1RNP抗體同時(shí)出現(xiàn)?？菇M蛋白抗體在核周型ANA標(biāo)本中的陽(yáng)性率最高(41.7%),在各種ANA熒光核型中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.610,P＜0.05),抗Jo-1抗體、抗Scl-70抗體抗著絲點(diǎn)抗體和抗P0抗體檢出例數(shù)較少,在各種熒光核型中的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 抗ENA抗體與各種熒光核型的結(jié)果分析

3 討論

本研究共1084份樣本檢測(cè)了ANA抗體,其中399例ANA抗體陽(yáng)性,即:在懷疑自身免疫性疾病患者中的ANA陽(yáng)性率36.81%(399/1084),稍低于文獻(xiàn)報(bào)道的39.9%[2]。這一結(jié)果提示新疆石河子地區(qū)ANA陽(yáng)性率與其他地區(qū)有不同。

本研究1084份樣本中僅512份樣本聯(lián)合檢測(cè)ANA抗體和抗ENA抗體,兩種檢測(cè)方法吻合度Kappa值為0.249。表明:這兩種檢測(cè)方法的吻合程度不好(Kappa＜0.7)。值得注意的是:有343例ANA陰性的血清標(biāo)本中出現(xiàn)80例抗ENA抗體陽(yáng)性,假陰性率為 23.3%(80/343),原因可能與本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)ANA抗體的方法學(xué)有關(guān)。2009年2月美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)聲明 :間接免疫熒光法是檢測(cè)ANA的金標(biāo)準(zhǔn),使用的是喉癌上皮細(xì)胞(Hep-2細(xì)胞),此細(xì)胞包含有100-150種自身抗原,這種方法既能檢測(cè)出細(xì)胞核型也能夠檢測(cè)出相應(yīng)核型的滴度,并且能夠檢測(cè)出其它檢測(cè)方法所不能檢測(cè)出的自身抗原。而本實(shí)驗(yàn)室因檢測(cè)成本原因采用鼠肝印片檢測(cè)ANA抗體,雖然能基本滿足ANA檢測(cè)要求,但很可能導(dǎo)致部分ANA抗體陽(yáng)性標(biāo)本漏檢。故建議應(yīng)參照[3]NCCLS的關(guān)于IIF ANA檢測(cè)的質(zhì)量保證操作指南并加以實(shí)施,同時(shí)參加室間質(zhì)評(píng)以提高ANA檢測(cè)結(jié)果的正確性。另外,169例ANA抗體陽(yáng)性的標(biāo)本中88例抗ENA抗體陰性,提示用抗ENA抗體檢測(cè)試劑盒未能檢測(cè)出某些自身抗體。因此,有必要進(jìn)一步純化多種生化性質(zhì)明確的抗原,并且進(jìn)一步研究新的自身抗原,擴(kuò)展抗ENA抗體譜,以提高抗體的檢出率。2009年一種新的自身抗原HnRNP H1[4]被發(fā)現(xiàn),相信在不久的將來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的診斷指標(biāo)并應(yīng)用于臨床,為自身免疫性疾病的早期診斷與及時(shí)治療提供有力的幫助。各型ANA標(biāo)本中抗ENA抗體陽(yáng)性率比較結(jié)果(見(jiàn)表2),表明:混合型ANA標(biāo)本中抗ENA抗體陽(yáng)性率最高:75%(3/4)。核斑點(diǎn)型次之:64.5%(20/31),核周型陽(yáng)性率為58.3%(7/12),核均質(zhì)型陽(yáng)性率達(dá)41.8%(51/122),各型陽(yáng)性率差異有顯著性(χ2=37.997,P=0.000)。有文獻(xiàn)報(bào)道[5]:各型ANA標(biāo)本中抗ENA抗體陽(yáng)性率最高的是斑點(diǎn)型(53.8%),其次是均質(zhì)型(49.4%)、核周型(16.7%)、混合型(28.9%)。結(jié)果表明:本地區(qū)的漢族人群的ANA標(biāo)本中抗ENA抗體陽(yáng)性率有自身特點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映不同熒光核型的ANA與抗ENA抗體之間的關(guān)系有各自的特點(diǎn)見(jiàn)表3。169例ANA陽(yáng)性標(biāo)本中72.18%是核均質(zhì)型,主要與抗R0/SSA 60有關(guān)。而車友英[2]等報(bào)道有所不同:核均質(zhì)型與 dsDNA、Histone和/或核小體抗體陽(yáng)性有關(guān)。ANA陽(yáng)性標(biāo)本中18.3%是斑點(diǎn)型ANA,主要與抗R0/SSA 60、抗U1RNP、抗Sm抗體相關(guān),與魏方等[7]報(bào)道一致。核周型ANA僅僅12例,核周型ANA與抗R0/SSA60、抗dsDNA、抗核小體抗體、抗組蛋白抗體等均相關(guān)?？筍cl-70抗體本文統(tǒng)計(jì)的陽(yáng)性率低,僅為4.1%,見(jiàn)于均質(zhì)型ANA。與魏方[6]的文獻(xiàn)報(bào)道的不一致,其原因可能是抗 ENA抗體試劑盒對(duì)抗Scl-70抗體的敏感性低有關(guān)?？笿o-1抗體僅1例陽(yáng)性,為核均質(zhì)型,在今后的工作中必須對(duì)抗Scl-70抗體和抗Jo-1抗體檢測(cè)引起足夠的重視。由以上分析可知:雖然ANA與抗ENA抗體之間有一定的關(guān)系,例如:核均質(zhì)型ANA主要與R0/SSA有關(guān),斑點(diǎn)型ANA主要與抗U1RNP、抗Sm抗體相關(guān)。但 dsDNA抗體和抗Scl-70抗體與多種ANA核型有關(guān),且各地報(bào)道也不一致。因此,一種自身抗體可以出現(xiàn)不同的熒光染色核型,不同的自身抗體可以出現(xiàn)相同的熒光核型,ANA的熒光核型與抗ENA抗體類型沒(méi)有絕對(duì)的規(guī)律可尋。必須用間接免疫熒光法篩查ANA,并聯(lián)合檢測(cè)抗ENA抗體譜,才能基本上確定ANA靶抗原的具體類型,從而體現(xiàn)出對(duì)自身免疫性疾病的診斷與鑒別診斷的價(jià)值。

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