許 衛(wèi) 萍, 田 晶

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

微生物代謝組學(xué)力求全面地定性和定量細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)所有的低分子質(zhì)量(<1 000)的代謝物,該技術(shù)可通過考察生物體系受到刺激或擾動(dòng)(如某一特定的基因變異或環(huán)境變化)后,其代謝產(chǎn)物的波動(dòng)或其隨時(shí)間的變化規(guī)律來研究生物體系的代謝表型改變[1-2],目前已廣泛應(yīng)用于微生物的生理研究[3]。作者首先利用GC-MS分析E.coli的野生型菌株Y 1.1566及其琥珀酸脫氫酶基因缺失突變株ΔsdhAB(S)兩株菌在甘氨酸為氮源條件下的代謝指紋,然后通過多變量數(shù)據(jù)處理,找到在兩株菌細(xì)胞內(nèi)濃度差異較大的化合物,繼而分析并解釋氮源差異對(duì)菌株代謝特別是氨基酸代謝的影響。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 菌 株

E.coli的野生型菌株Y 1.1566及其琥珀酸脫氫酶基因缺失突變株ΔsdhAB(S)由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供。

1.2 儀器和試劑

儀器:GC-MS QP2010,日本Shimazu公司；超低溫冰箱NU-6518E,NUAIRE -86 ℃ Ultralow Freezer；真空冷凍干燥機(jī)FREEZONE4.5,美國Labconco公司；Biofuge stratos高速冷凍離心機(jī),德國Kendro公司。

試劑:癸酸,吡啶,有機(jī)酸,氨基酸,N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA+1%TMCS)均購于SIGMA公司；甲醇、氯仿、乙腈(HPLC級(jí))購于Tedia。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.3.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉湯19.8 g/L。

全合成培養(yǎng)基(mg/L):組成見文獻(xiàn)[4]。

1.3.2 培養(yǎng)條件

兩株菌在LB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng):35 ℃,160 r/min的通氣恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)12 h；取活化后的菌液1%,5 mL生理鹽水洗菌體2次,轉(zhuǎn)接入全合成培養(yǎng)基中,250 mL三角瓶裝液量為100 mL,在35 ℃、160 r/min的通氣恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)12 h。每株菌平行培養(yǎng)6次共產(chǎn)生12個(gè)樣品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞干重及菌體生長的光密度測定

取5 mL菌液離心所得沉淀,用生理鹽水洗凈后在60～100 ℃的烘箱中烘干5 h,稱重至恒重(g),細(xì)胞質(zhì)量濃度(g/L)為(m×1 000)/V,菌體的生長情況可以用600 nm下的光密度(OD600)來表示。細(xì)胞干重按照文獻(xiàn)[5]的方法計(jì)算。

1.4.2 樣品淬滅和提取

淬滅方法選擇冷乙腈淬滅法:取3 mL對(duì)數(shù)生長期[6]的菌液加入到12 mL冷乙腈中,放入-80 ℃冰箱中淬滅15 min,在4 ℃低溫下,10 000g離心10 min,棄去上清液。

提取方法選擇甲醇/氯仿提取方法,1.5 mL甲醇和0.75 mL去離子水分別加入每個(gè)樣品中,同時(shí)加入100 μL 0.3 mg/mL的內(nèi)標(biāo)癸酸。渦旋1 min后,每個(gè)樣品加1.5 mL氯仿,在4 ℃條件下靜置10 min, 然后離心分層,取甲醇/水層1 mL冷凍干燥[7]。

1.4.3 衍生方法

在凍干后的胞內(nèi)代謝物中加入50 μL吡啶,超聲(480 W)10 min溶解后,再加入60 μL BSTFA+1%TMCS,75 ℃水浴45 min。10 000g離心10 min后取上清用于GC-MS分析。BSTFA+1%TMCS衍生試劑是用三甲基硅烷基團(tuán)(+72)取代—COOH、—NH2、—SH、—SO2H和—OH上的活潑氫,使不揮發(fā)的化合物能夠在氣相色譜上檢測出來。

1.4.4 GC-MS分析方法

色譜柱:DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣1 μL；分流比10∶1；70 ℃ (5 min)―5 ℃/min―280 ℃ (5 min)；載氣體積流量He 1.5 mL/min；MS:進(jìn)樣口280 ℃,離子源200 ℃,傳輸線280 ℃,離子掃描:40～600m/z;溶劑延遲5 min;檢測電壓1 400 V。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

生成峰表:包括峰號(hào)、保留時(shí)間、峰面積的峰表由工作站自動(dòng)積分生成,積分斜率100,最小峰面積10 000。用內(nèi)標(biāo)癸酸歸一化后輸入SIMCA-P軟件(Umea,瑞典)中進(jìn)行模式識(shí)別分析,首先使用PCA進(jìn)行表型區(qū)分,再使用PLS-DA方法尋找代謝差異,并用VIP(variable importance in the projection)和“S-plot”篩選潛在標(biāo)記物。

1.4.6 代謝物定性

實(shí)驗(yàn)使用NIST庫(National Institute of Standards and Technology)作為定性的標(biāo)準(zhǔn)譜庫,定性過程由儀器工作站完成。定性信息如相似度、CAS號(hào)和化合物名稱列于峰表內(nèi)。相似度大于75的化合物認(rèn)為定性結(jié)果可靠,部分化合物由標(biāo)樣驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩株菌生長曲線比較

圖1為采用比濁法測定E.coli的野生型菌株Y1.1566及其琥珀酸脫氫酶基因缺失突變株ΔsdhAB(S)的生長曲線。由圖1可知,在氮源限制培養(yǎng)條件下,與野生型菌株Y1.1566相比琥珀酸脫氫酶基因缺失突變株ΔsdhAB(S)具有顯著的不同。ΔsdhAB(S)的生物量明顯低于Y1.156 6,由此可知,敲除ΔsdhAB(S)對(duì)于菌株生長較為不利[5]。

圖1 兩株菌的生長曲線

2.2 兩株菌代謝差異分析

利用有監(jiān)督模型識(shí)別方法PLS-DA對(duì)兩株菌代謝差異進(jìn)行分析,并找出在分類中起重要作用的潛在變量。對(duì)于PLS-DA模型一般認(rèn)為R2Y(分類信息解釋能力)至少大于0.5,同時(shí)R2Y和Q2(預(yù)測率)之間差在0.2～0.3。由圖2可以看出,R2Y為0.995,Q2為0.967說明模型有很好的預(yù)測能力并對(duì)分類信息解釋能力較強(qiáng),能很好地將兩類樣品分開。

圖2 Y1.1566和ΔsdhAB在氮源限制培養(yǎng)條件下的PLS-DA模型

2.3 潛在標(biāo)記物的選擇

PLS-DA模型中一般認(rèn)為VIP大于1的變量均可認(rèn)為是潛在標(biāo)記物。在將潛在標(biāo)記物與生物學(xué)信息相關(guān)聯(lián)前,需對(duì)潛在標(biāo)記物進(jìn)行篩選。PLS-DA模型VIP大于1的共有132個(gè)代謝物,大于2的共有30個(gè)[圖3(a)]。在S-plot上,有14個(gè)代謝物位于“S”兩端[圖3(b)],這意味著它們對(duì)分類貢獻(xiàn)度和可靠性較高,因此被確定為潛在標(biāo)記物,最后經(jīng)過t檢驗(yàn)篩選出8個(gè)顯著性高的化合物(表1)。

結(jié)合圖3(a)、3(b)及表1可以看出,一些胞內(nèi)代謝物濃度在兩株菌中發(fā)生了變化。VIP最大為吡喃葡萄糖苷,其次為葡萄糖醇和甘氨酸。雖然琥珀酸脫氫酶被敲除,但琥珀酸濃度變化對(duì)兩株菌代謝區(qū)分的貢獻(xiàn)只占很小一部分(VIP=1.88)。這也間接說明了一個(gè)較普遍的現(xiàn)象:從代謝物水平看,遺傳改造的靶點(diǎn)往往不是直接受到最大影響之所在。在氮源限制條件下,E.coli野生型與敲除琥珀酸脫氫酶基因型菌株的生長由于遺傳的改變,其生長狀態(tài)及體內(nèi)代謝都受到影響。而對(duì)于敲除琥珀酸脫氫酶基因型的S菌,雖然琥珀酸在體內(nèi)得到積累,但并不是變化最顯著的化合物。琥珀酸作為TCA的中間代謝產(chǎn)物,在有氧環(huán)境下,不會(huì)過多積累,這與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的結(jié)果是一致的。

圖3 多變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

由于本研究所用培養(yǎng)基為甘氨酸氮源,因此又著重對(duì)細(xì)胞內(nèi)氨基酸之間的變化進(jìn)行了分析。對(duì)所鑒定的氨基酸之間相關(guān)系數(shù)具有顯著性(p<0.05)的化合物,構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖見圖4。從圖4中可以看出敲基因(a)和野生型(b)株中,脯氨酸、異亮氨酸與谷氨酰胺之間的關(guān)系發(fā)生的變化最明顯。

3 結(jié) 論

氮源限制條件下,E.coli敲基因型菌株由于琥珀酸脫氫酶的敲除,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)諸多代謝物濃度發(fā)生變化,尤其是調(diào)節(jié)高滲狀態(tài)生長特性的氨基酸發(fā)生變化,生長曲線反映了S株生長受到抑制。本研究也說明單個(gè)基因的改變引起的代謝變化是比較廣泛的。

圖4 細(xì)胞內(nèi)主要氨基酸代謝物相關(guān)分析

[1] FRIEDMANN H C. From “butyribacterium” to “E.coli”:an essay on unity in biochemistry[J]. Biology and Medicine, 2004, 47(1):47-66.

[2] HOLMES J C, MORRELL F A. Oscillographic mass spectrometric monitoring of gas chromatography[J]. Applied Spectroscopy, 1957, 11(2):86-87.

[3] RAAMSDONK L M, TEUSINK B, BROADHURST D, et al. A functional genomics strategy that uses metabolome data to reveal the phenotype of silent mutations[J]. Nature Biotechnology, 2001, 19(1):45-50.

[4] ANKE K, JAN W, VOLKER H ,et al. Metabolic flux analysis ofEscherichiacoliin glucose-limited continuous culture I. Growth-rate dependent metabolic efficiency at steady state[J]. Microbiology, 2005, 151(3):693-706.

[5] TIAN Jing, SHI Chunyun, GAO Peng, et al. Phenotype differentiation of threeE.colistrains by GC-FID and GC-MS based metabolomics[J]. Journal of Chromatography B:Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2008, 871(2):220-226.

[6] KLAMT S, STELLING J, GINKEL M, et al. FluxAnalyzer:exploring structure, pathways, and flux distributions in metabolic networks on interactive flux maps[J]. Bioinformatics, 2003, 19(2):261-269.

[7] HANNES L, BERND A, DIRK W. Leakage of adenylates during cold methanol/glycerol quenching ofEscherichiacoli[J]. Metabolomics, 2008, 4(3):240-247.

[8] WENDISCH F V, BOTT M, EIKMANNS B J. Metabolic engineering ofEscherichiacoliand Corynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic acids and amino acids[J]. Current Opinion Microbiology, 2006, 9(3):268-274.