黨秋玲，劉 馳，席北斗，魏自民，李鳴曉，楊天學(xué)，李 曄

1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院水環(huán)境系統(tǒng)工程研究室，北京 100012

生活垃圾堆肥過(guò)程中細(xì)菌群落演替規(guī)律

黨秋玲1，2，劉 馳2，席北斗2，魏自民1*，李鳴曉1，楊天學(xué)2，李 曄1

1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院水環(huán)境系統(tǒng)工程研究室，北京 100012

應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究生活垃圾堆肥過(guò)程中的細(xì)菌群落演替規(guī)律，對(duì)堆肥不同時(shí)期的宏基因組DNA進(jìn)行提取，擴(kuò)增16S rDNA的V3區(qū)，分析生活垃圾堆肥過(guò)程中細(xì)菌群落的變化.DGGE圖譜表明，隨著堆體溫度的升高，DNA條帶表現(xiàn)出了明顯的動(dòng)態(tài)變化，降溫期出現(xiàn)了新的優(yōu)勢(shì)條帶并趨于穩(wěn)定，說(shuō)明堆肥不同時(shí)期的細(xì)菌群落發(fā)生了更替.對(duì)條帶分布進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明:以55℃為界，將14個(gè)堆肥樣品劃分為2個(gè)族，族間的相似性僅為13%，說(shuō)明堆肥過(guò)程中常溫期(＜55℃)和高溫期(＞55℃)微生物群落結(jié)構(gòu)差別較大.對(duì)優(yōu)勢(shì)條帶回收測(cè)序的結(jié)果表明:在升溫期，堆肥堆體中檢測(cè)到H.obtusa和人類排泄物中的細(xì)菌;但隨著溫度的升高，具有纖維素降解功能的嗜熱微生物Clostridium thermocellum成為堆肥高溫期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌;當(dāng)堆體溫度小于55℃時(shí)出現(xiàn)了大量的未培養(yǎng)微生物.

生活垃圾;堆肥;PCR;DGGE;細(xì)菌群落演替

Abstract:The PCR-DGGE technique was used to study the dynamic succession law of bacterial communities during composting of Municipal Solid Waste(MSW).The microbialmetagenom ic DNA was extracted from samples in different periods of composting，and the V3 region of 16S rDNA was amplified for analyzing the change of the bacterial community during the composting process. DGGE prints showed that the bacterial community changed dramatically with the rise of temperature.New predominant bacteria appeared at the end of the composting process.This indicated that the bacterial community changed in different composting periods.Clustering analysis results showed that 14 samples were divided into two families at 55℃.The similarity of the two families was only 13%，indicating that the bacterial community structure was different in the normal temperature process(＜55℃)and high temperature process(＞55℃)，The results of DNA sequencing showed that:caterpillar pathogenH.obtusaand human waste samp le gene were detected in the rising temperature period;thermophilic microbeClostridium thermocellu，which can decompose cellulose，was the dominant group in the high-temperature composting;and，lots of uncultured bacterial appeared when the temperature was lower than 55℃.

Keywords:domestic waste;compost;PCR;DGGE;bacteria community succession

生活垃圾好氧堆肥是實(shí)現(xiàn)其資源化、無(wú)害化利用的一種重要方式，其本質(zhì)是由群落結(jié)構(gòu)演替非常迅速的微生物群體協(xié)同作用于堆肥基質(zhì)的生理生化過(guò)程［1-3］.對(duì)堆肥過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的研究是了解堆肥過(guò)程中微生物作用機(jī)理和為生物強(qiáng)化堆肥提供技術(shù)支撐的必要前提，然而傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法不能很好地反映堆肥過(guò)程中的微生物多樣性變化的本質(zhì)［4］.基于16S rDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) -變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)可通過(guò)圖譜特征分析系統(tǒng)中微生物的群落變化規(guī)律，目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于固體廢物、水體和土壤等研究中［5-8］，但用于研究堆肥過(guò)程中微生物動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的較少.

筆者應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究生活垃圾好氧堆肥過(guò)程中細(xì)菌群落演替規(guī)律，以期為堆肥過(guò)程微生物的作用機(jī)理及堆肥工藝參數(shù)的優(yōu)化提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 堆肥原料

將從北京市某生活垃圾綜合處理廠取回的生活垃圾進(jìn)行分揀，剔除難降解物質(zhì)，如塑料(所占比例6.5%)、玻璃和磚石(所占比例4.2%)等，將可降解有機(jī)生活垃圾粉碎至粒徑≤5 cm.將中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院收割的雜草晾干，剁碎至2～3 cm，用其調(diào)節(jié)堆肥碳氮比.有機(jī)成分的理化性質(zhì)見(jiàn)表1.

表1 堆肥原料基本理化參數(shù)Table 1 Some basic characteristics of composting materials

1.2 堆肥試驗(yàn)及樣品采集

調(diào)節(jié)初始含水率為60.11%，碳氮比為26.1，pH為7.13，通風(fēng)量為0.5 L/(min·kg).從堆肥開(kāi)始每隔24 h分別在距堆心15，20和25 cm深度處取等量樣品200 g混勻，平均為2份.其中一份樣品用于測(cè)定實(shí)時(shí)pH和含水率等理化參數(shù)，另一份保存于-20℃冰箱用于后續(xù)分析.

1.3 PCR-DGGE分析

1.3.1 堆肥樣品基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

堆肥樣品經(jīng)脫腐緩沖溶液洗滌去除腐殖質(zhì)，用Omega土壤 DNA提取試劑盒進(jìn)行總基因組DNA的提取，然后對(duì)16S rDNA的V3區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增. 擴(kuò)增引物采用細(xì)菌通用引物 534r (ATTACCGCGGCTGCTGG)和 341 f(CCTACGG GAGGCAGCAG)［9］，由上海生工合成，其中正向引物5'端連接有GC夾板(CGCCCGGGGCGCGCC CCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)，以提高在后期DGGE電泳時(shí)的解鏈范圍［10］.PCR擴(kuò)增體系為:10μmol/L正反向引物各1μL，10×Taq Buffer 5μL，25 mmol/L的MgCl24μL，10 mmol/L的dNTP溶液1μL，2.5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，模板DNA 2μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至50μL.擴(kuò)增條件:采用降落式(touchdown)PCR，94℃預(yù)變性5 m in，94℃變性1 min，68℃退火30 s，每個(gè)循環(huán)降1℃，經(jīng)過(guò)10個(gè)循環(huán)后，退火溫度降至58℃，72℃延伸1 m in，94℃變性1 m in，58℃退火30 s，72℃延伸1 m in，25個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min，最后4℃保溫.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

1.3.2 DGGE凝膠電泳及圖譜分析

DGGE試驗(yàn)條件參考 YU等［11-12］的試驗(yàn)并進(jìn)行了改進(jìn).采用Bio-Rad公司 DcodeTM的基因突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離.DGGE聚丙烯酰胺凝膠濃度為 8%，變性梯度為 35% ～60%，電泳緩沖液為1×TAE，電壓80 V，60℃條件下電泳16 h.電泳結(jié)束后用SYBR GreenⅠ(1∶10 000)染色30 min，用UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照.

利用BIO-RAD QUANTITY ONE 4.6.2軟件對(duì)所得 圖譜進(jìn)行處 理，用戴斯系數(shù) (Dice Coefficient，CS)計(jì)算微生物群落的相似性:

式中，j為樣品A和B共有的條帶;a和b分別為樣品A和B中各自的條帶數(shù).戴斯系數(shù)為0(沒(méi)有相同條帶)～1(所有的條帶相同).依據(jù)Complete Linkage算法對(duì)DGGE條帶進(jìn)行聚類分析.

1.3.3 優(yōu)勢(shì)條帶的切膠回收和測(cè)序分析

用無(wú)菌的手術(shù)刀在345 nm波長(zhǎng)下將優(yōu)勢(shì)條帶切下，放在2 mL無(wú)菌離心管中，并用 tip頭搗碎，加入60μL TE緩沖溶液，4℃放置24 h，取10 ng DNA進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，引物和擴(kuò)增條件見(jiàn)1.3.1節(jié)，擴(kuò)增產(chǎn)物交由北京三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序.將測(cè)序結(jié)果提交到 Genebank中利用BLAST軟件與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov)，獲得同源性最大的菌屬16S rDNA序列［13］.

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥過(guò)程理化參數(shù)變化

圖1為堆肥過(guò)程中的主要理化參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化.由圖1可知，堆體溫度在第2天就上升到54℃，并在50℃以上維持了10 d，最高溫度達(dá)74℃，能有效殺滅堆肥中的致病菌;堆肥體系的pH始終呈弱堿性，最大值出現(xiàn)在高溫期后期，堆肥結(jié)束時(shí)在7.5以下;堆肥的含水率始終維持在60%左右，可能是由于整個(gè)堆肥過(guò)程在3月進(jìn)行，室溫較低，反應(yīng)器內(nèi)外溫差較大所致;w(有機(jī)質(zhì))由初始的 58.81% 降 到 32.31%;堆 肥 過(guò) 程 中w(水溶性有機(jī)碳)/w(水溶性有機(jī)氮)呈下降趨勢(shì)，由初始的 34.7降到 5.4，李國(guó)學(xué)等［14］研究認(rèn)為， 堆 肥 腐 熟 時(shí)w(水溶性有機(jī)碳)/w(水溶性有機(jī)氮)在4～6之間，該研究在第16天即降到了6以下，可以認(rèn)為堆肥已經(jīng)腐熟.

圖1 堆肥理化參數(shù)變化Fig.1 The change of physical and chem ical parameters

2.2 堆肥樣品基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增結(jié)果

由于堆肥過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的腐殖質(zhì)類物質(zhì)，且腐殖質(zhì)會(huì)嚴(yán)重影響DNA的提取和PCR的擴(kuò)增效果［15］，因此在用土壤DNA試劑盒提取前對(duì)樣品進(jìn)行了預(yù)處理，即分別用 PBS緩沖溶液和添加了PVP的脫腐緩沖溶液進(jìn)行充分洗滌，直至樣品溶液呈較清的顏色.如圖2所示，經(jīng)試劑盒提取后的基因組DNA片段大小在23 kb左右，無(wú)需純化可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增產(chǎn)物片段在230 bp左右，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收后的各樣品均適宜進(jìn)行后續(xù)DGGE分析.

2.3 DGGE指紋圖譜分析

PCR-DGGE圖譜中處于不同位置的DNA條帶及其亮度的強(qiáng)弱代表細(xì)菌群落中某一特定微生物及其在群落中的相對(duì)豐度［16］，條帶數(shù)目越多表示細(xì)菌種類越豐富.如圖3所示，隨著堆肥的進(jìn)行，堆肥樣品中的細(xì)菌呈現(xiàn)出不同的條帶分布.第1天的堆肥樣品條帶呈 smart狀，表明堆肥初期細(xì)菌數(shù)量雖多但優(yōu)勢(shì)種群不明顯，可能是由于堆肥初期的微生物多樣性很高，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物太少而不能形成明顯的條帶［17］.隨著堆肥溫度的升高，出現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)條帶，并伴有優(yōu)勢(shì)條帶的更迭現(xiàn)象.這說(shuō)明在堆肥過(guò)程中微生物表現(xiàn)出了明顯的動(dòng)態(tài)變化.條帶a，b，c和d只出現(xiàn)在圖譜的前2天，且條帶較亮，為升溫期的優(yōu)勢(shì)種屬，后期由于不適應(yīng)堆肥的高溫環(huán)境而逐漸在DGGE圖譜上消失，條帶e，f，g，h，i，j和 k一直出現(xiàn)在堆肥高溫期(＞55℃)的DGGE圖譜上，較為清晰，說(shuō)明該類微生物在此階段數(shù)量較多，為高溫期的優(yōu)勢(shì)微生物.降溫期和二次發(fā)酵期又出現(xiàn)了新的細(xì)菌種群(如條帶l，m，n和o)，一直持續(xù)到堆肥結(jié)束.這些微生物的出現(xiàn)和持續(xù)存在，為 ISHII等［18］提出的以出現(xiàn)特征微生物作為堆肥腐熟標(biāo)志的設(shè)想提供了試驗(yàn)依據(jù).

圖2 基因組DNA的瓊脂糖凝膠和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖像Fig.2 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of different samples and Agarose gel electrophoresis of PCR amplified 16SrDNA

圖3 DGGE凝膠電泳圖像Fig.3 DGGE patterns produced from different sample

2.4 DGGE圖譜相似性分析

用Quantity one 4.6.2軟件將DGGE圖譜數(shù)字化后，按照 Complete Linkage算法進(jìn)行聚類分析.由圖4可知，依據(jù)堆體溫度(55℃)，將14個(gè)堆肥樣品劃分為2個(gè)族，族間的相似性僅為13%.表明溫度變化對(duì)堆肥中微生物種群結(jié)構(gòu)影響較大，可以將55℃作為堆肥微生物群落結(jié)構(gòu)躍遷的一個(gè)標(biāo)志性溫度.

各時(shí)期堆肥樣品中微生物 DNA序列的相似性見(jiàn)表2.表2中的數(shù)字表示各樣品間的相似程度，數(shù)字越大表明其微生物種類和數(shù)量越接近，數(shù)字越小，說(shuō)明其差別越大［19］.從表2可知，不同時(shí)期的微生物種群相似性較低，升溫期和高溫期的相似性僅為18%(第1天和第10天)，高溫期和降溫期的相似性僅為22.4%(第8天和第12天)，高溫期和二次發(fā)酵期的相似性僅為12.6%(第8天和第18天).說(shuō)明好氧堆肥過(guò)程中，堆體內(nèi)微生物的群落演替激烈，這可能和堆肥過(guò)程中堆體的溫度區(qū)間跨度較大(6～74℃)有關(guān)，而每種微生物都有其生長(zhǎng)的最適溫度范圍，超出這個(gè)范圍其生長(zhǎng)繁殖都將受到抑制，這也說(shuō)明了通過(guò)高溫好氧堆肥可以殺滅常溫狀態(tài)下存在于堆體內(nèi)的病原微生物，實(shí)現(xiàn)生活垃圾無(wú)害化處理的目的.同一堆肥階段的微生物種群表現(xiàn)出相對(duì)較好的相似性，其中堆肥第4天和第5天的相似性達(dá)到72%，說(shuō)明當(dāng)堆體溫度變化不大時(shí)，對(duì)微生物的群落結(jié)構(gòu)影響也較小.因此，溫度變化對(duì)微生物的群落演替起到了重要的決定性作用.

圖4 DGGE圖譜的聚類分析Fig.4 The clustering analysis for DGGE patterns

表2 基于戴斯系數(shù)(CS)的相似性矩陣Table 2 Similarity matrix based on Dice cofficient for DGGE patterns

2.5 堆肥過(guò)程中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的測(cè)序分析

將圖3中標(biāo)記的DGGE條帶回收測(cè)序后得到8個(gè)較好的結(jié)果，將該測(cè)序結(jié)果提交到 Genebank中進(jìn)行比對(duì).由表3可知，其中大部分為未培養(yǎng)細(xì)菌的16S rDNA V3區(qū)片段，其同源性均大于92%.與堆肥升溫期(＜55℃)條帶b和d所代表的微生物種屬同源性最大的細(xì)菌為H.obtusa和人類排泄物中細(xì)菌，最大相似性分別為95%和94%.H. obtusa是一種能夠感染纖毛蟲(chóng)并在其體內(nèi)寄生的G+病原菌［20］，條帶b和d所代表的微生物對(duì)復(fù)雜變化的堆肥條件適應(yīng)能力較差，當(dāng)溫度高于55℃時(shí)就在DGGE圖譜上消失了，說(shuō)明堆肥高溫期能有效地殺滅致病菌.條帶 e所代表的微生物菌屬一直是堆肥高溫期(第3～12天)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，與其同源性最大的細(xì)菌為Clostridium thermocellum，最大相似性為98%.Clostridium thermocellum是具有纖維素降解功能的嗜熱細(xì)菌，說(shuō)明該菌在堆肥高溫期對(duì)生活垃圾中纖維素的降解起到了重要作用.解開(kāi)治等［21］在豬糞堆肥過(guò)程中也檢測(cè)到了該種細(xì)菌;在堆肥高溫期的前期(第3～7天)出現(xiàn)了大量未培養(yǎng)的Bacillussp.和堆肥細(xì)菌，并成為該時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌群.Bacillussp.有木質(zhì)素降解能力［22］，表明在進(jìn)入高溫期已經(jīng)有大量降解木質(zhì)素的微生物存在.NIISAWA等［23］在研究海洋動(dòng)物資源堆肥產(chǎn)品時(shí)也檢測(cè)到了未培養(yǎng)堆肥細(xì)菌.腐熟期在堆體中出現(xiàn)了大量未培養(yǎng)的Clostridiumsp.和未培養(yǎng)的Firmicutesbacterium.

由于用于DGGE研究的細(xì)菌16S rDNA序列只有193 bp，在種屬鑒定中只能鑒定到屬，無(wú)法進(jìn)行種的鑒定，因此，在今后的研究中還需要結(jié)合其他分子生物學(xué)方法對(duì)堆肥過(guò)程中微生物進(jìn)行更全面的分析.

表3 條帶序列的比對(duì)結(jié)果Table 3 Blast results of the band sequences

3 結(jié)論

a.經(jīng) PVP緩沖溶液洗滌過(guò)的堆肥樣品可直接用土壤基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行有效提取，提取后的DNA可直接用于后續(xù)分析，且能得到較好效果.

b.生活垃圾好氧堆肥過(guò)程中細(xì)菌多樣性較為豐富，堆肥不同階段細(xì)菌群落演替較快，溫度對(duì)微生物的群落演替起到了重要的限制作用，微生物和溫度間的相互制約關(guān)系推進(jìn)了堆肥的進(jìn)程.

c.測(cè)序結(jié)果表明，在堆肥的升溫期檢測(cè)到了H.obtusa和人類排泄物中的細(xì)菌;在高溫期檢測(cè)到了纖維素降解菌Clostridium thermocellum，作為該時(shí)期的優(yōu)勢(shì)微生物，其對(duì)堆肥過(guò)程中纖維素的降解發(fā)揮了重要作用.在整個(gè)堆肥過(guò)程中檢測(cè)到了大量的不可培養(yǎng)微生物，并作為堆肥腐熟期的優(yōu)勢(shì)菌群.

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Dynam ic Succession Law o f Bacterial Comm unities during Dom estic Waste Com posting

DANG Qiu-ling1，2，LIU Chi2，XIBei-dou2，WEI Zi-m in1，LIMing-xiao1，YANG Tian-xue2，LIYe1
1.College of Life，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China
2.Water Environment System Project Laboratory，Chinese Research Academy of Environmental Sciences，Beijing 100012，China

X705

A

1001-6929(2011)02-0236-07

2010-08-16

2010-10-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(50878201);國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2009BADC2B04，2006BAC06B04);農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2008GB24420470)

黨秋玲 (1982 -)， 女， 黑 龍 江 克 山 人，dangling819@126.com.

*責(zé)任作者，魏自民(1970-)，男，黑龍江依安人，教授，博士，博導(dǎo)，主要從事固體廢棄物處理處置研究，weizm691120@163.com