劉石泉 趙運(yùn)林 胡治遠(yuǎn) 雷存喜

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128;2.湖南城市學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程系，湖南 益陽 413000;3.黑茶研究所，湖南益陽 413000)

茯磚茶屬于后發(fā)酵茶，是所有茶類中加工工藝最復(fù)雜、生產(chǎn)加工周期最長(zhǎng)、工藝最獨(dú)特的黑茶類產(chǎn)品。在茯磚茶制造中，選用黑毛茶為原料，通過篩分、汽蒸、握堆、稱茶、蒸茶、壓制、包裝、發(fā)花、干燥、檢驗(yàn)等工序制成［1］。其中發(fā)花是茯磚茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序。黑毛茶經(jīng)渥堆、發(fā)酵及發(fā)花工藝產(chǎn)生金黃色的冠突散囊菌(Aspergillus Cristatus(Raper＆Fennell)Malloch＆Cain，該菌俗稱金花)使茯磚茶內(nèi)質(zhì)金花普茂，獨(dú)具菌花香，湯色紅濃、香氣純正、滋味醇和。一直以來，茯磚茶是作為邊疆少數(shù)名族日常生活中不可或缺的必備品，在邊疆享有“寧可三日無糧，不可一日無茶”的美譽(yù)，其奧妙與茯磚茶的品質(zhì)風(fēng)味是不可分割的［2］。歷來邊疆少數(shù)民族通過判斷金花質(zhì)量和數(shù)量來衡量茯磚茶的品質(zhì)優(yōu)劣［3］，開發(fā)優(yōu)質(zhì)品牌茯磚茶，發(fā)展壯大茯磚茶產(chǎn)業(yè)、夯實(shí)品牌基礎(chǔ)，顯然離不開冠狀散囊菌的分子生物學(xué)如DNA、蛋白質(zhì)等研究。本研究旨在對(duì)茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌種——冠狀散囊菌進(jìn)行DNA提取方法的比較研究，為后續(xù)冠狀散囊菌的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)行群體遺傳研究打下基礎(chǔ)。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，通過提取DNA來用基因工程技術(shù)改善微生物的目的產(chǎn)量已成為許多科學(xué)工作者正在探索的熱門課題，文獻(xiàn)檢索表明目前已有多種DNA的提取方法，但專門針對(duì)冠狀散囊菌DNA的提取方法未檢索到，我們認(rèn)為很有必要參考真菌的 DNA提取方法［5－7］，對(duì)冠狀散囊菌DNA的提取進(jìn)行系統(tǒng)的比較研究。因?yàn)楣跔钌⒛揖钦婧思?xì)胞，擁有結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)胞壁，難以破壞，所以提取冠狀散囊菌基因組DNA比提取大腸桿菌等細(xì)菌DNA要困難得多。本試驗(yàn)擬通過使用溶菌酶破壁法、纖維素酶破壁法、果膠酶破壁法、CTAB法、SDS法提取冠狀散囊菌菌絲體和子囊孢子的基因組DNA，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)、ITS序列的PCR擴(kuò)增檢測(cè)以及紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度。期望在前人研究方法的基礎(chǔ)上，摸索一套簡(jiǎn)便、易行的適于提取冠狀散囊菌總DNA的方法，獲得的總DNA含蛋白質(zhì)少、降解不明顯、產(chǎn)量較高、重復(fù)性好。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 從2007年益陽茶廠有限公司產(chǎn)金湘益特制禮品茯磚茶，采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，運(yùn)用平板梯度稀釋法分離獲得的茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌種——冠狀散囊菌。

1.1.2 儀器 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Z36HK)、Bio-Rad DNA電泳儀、紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810DASPC)、DNA擴(kuò)增儀(TC-25/H)、凝膠成像分析系統(tǒng)(Gellabsystem)等。

1.1.3 主要試劑 溶菌酶、纖維素酶、果膠酶、RNaseA等購(gòu)置于上海生物工程有限公司;使用的真菌通用引物［8］ITS1(5'– TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3') 和 ITS4(5'– TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')由上海生物工程有限公司合成;其他為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 溶液配制 DNA緩沖液:100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、10 mmol/L EDTA。

SDS 裂解液:2%Triton X-100、3%SDS(m/m)、0.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、50 mmol/L EDTA、2% β-巰基乙醇(v/v)用前加)。

CTAB 裂解液:100 mmol/L Tris-HCL(pH 8.0)、20 mmol/L EDTA(pH 8.0)、1.4 mol/L NaCl。

0.1mol/L 磷酸鈉緩沖液(pH 7.4):77.4 mL 0.1 mol/L Na2HPO4、22.6 mL 0.1 mol/L NaH2PO4。

山梨醇緩沖液:用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)配制1.2 mol/L 山梨醇。

溶菌酶、纖維素酶、果膠酶緩沖液:用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液分別配制成20 mg/mL酶液后用0.22 μm細(xì)菌濾膜過濾除菌。

PBS 緩沖液:0.01 mol/L Na2HPO4和 NaH2PO4(pH 7.0)、0.15 mol/L NaCl。

PDA液體培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮，稱取200 g，切成小塊放入燒杯中，加適量蒸餾水，煮沸1小時(shí)，稍冷后用雙層紗布過濾，加入蔗糖20 g，混勻，用量筒定容至1000 mL，趁熱分裝在三角瓶中，在1.1 kg/cm2(121℃)中保持20分鐘滅菌(固體培養(yǎng)基在滅菌前加1%的瓊脂)。

1.2 冠狀散囊菌基因組DNA提取方法

1.2.1 溶菌酶破壁法 冠狀散囊菌接種于50 mL PDA液體培養(yǎng)基中，28℃、280 rpm震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)96h，用無菌紗布過濾分開子囊孢子和菌絲體，室溫下10 000 rpm離心5 min收集子囊孢子，自然干燥后分別準(zhǔn)確稱取0.1 g子囊孢子和菌絲體，分別用PBS緩沖液1.5 mL重懸子囊孢子和菌絲體，室溫下10 000 rpm離心5 min收集子囊孢子和菌絲體;用山梨醇溶液100μL重懸，加入5μL 20 mg/mL溶菌酶37℃溫浴過夜(12h);液氮速凍，然后65℃水浴中溶解，反復(fù)3次;向懸浮液中加入150μL 5 mol/L KAc(pH8.9)輕輕混勻，然后12 000 rpm離心10 min;將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，輕輕顛倒數(shù)次，然后12 000 r/min離心10 min;重復(fù)抽提一次;轉(zhuǎn)移上清到新的1.5 mL離心管中，加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉溶液，輕輕混勻，－20℃ 放置30 min后12 000 rpm離心10min;除去上清，將沉淀溶解在100μL DNA緩沖液中，加入6 μL RNaseA(10 mg/mL)，37℃溫浴30 min，加入1/2 體積的7.5 mol/L NH4Ac(pH7.5)和等體積的異丙醇，－20℃放置30 min后12 000 r/min離心10 min;除去上清，加入500μL 70%乙醇漂洗沉淀2次，12 000 r/min離心5 min;風(fēng)干除去乙醇，用50 μL ddH2O溶解冠狀散囊菌DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 纖維素酶破壁法 操作同1.2.1，其中20 mg/mL溶菌酶換成含20 mg/mL纖維素酶溶液。

1.2.3 果膠酶破壁法 操作同1.2.1，其中20 mg/mL溶菌酶換成含20 mg/mL果膠酶溶液。

1.2.4 CTAB法 冠狀散囊菌的重懸子囊孢子和菌絲體液制備方法同1.2.1，分別取1.5 mL子囊孢子和菌絲體重懸液，室溫下10 000 r/min離心5 min收集孢子和菌絲體;分別用液氮碾磨破壁。加250 μL CTAB 裂解液混勻，65℃保溫1 h。10 000 r/min離心10 min。取上清，將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，輕輕顛倒數(shù)次，然后12 000 r/min離心10 min;重復(fù)抽提一次;然后轉(zhuǎn)移上清到新的1.5 mL離心管中，加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉溶液，輕輕混勻，－20℃放置30 min后12 000 rpm離心10 min;除去上清，將沉淀溶解在100μL DNA 緩沖液中，加入 6 μL RNaseA(10 mg/mL)，37℃溫浴30 min，加入1/2 體積的 7.5 mol/L NH4Ac(pH 7.5)和等體積的異丙醇，－20℃放置30 min后12 000 r/min離心10min;除去上清，加入500 μL 70%乙醇漂洗沉淀2次，12 000 r/min離心5 min;風(fēng)干除去乙醇，用50μLddH2O溶解冠狀散囊菌DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 SDS法 將250 μL CTAB裂解液換成加250 μL SDS 裂解液，其他操作同1.2.4。

1.3 冠狀散囊菌基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)

1.3.1 凝膠電泳檢測(cè) 基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，點(diǎn)樣2 μL，80 V恒定電壓40 min，然后用凝膠成像分析系統(tǒng)(Gellabsystem)拍照。

1.3.2 純度及濃度檢測(cè) 樣品稀釋100倍，終體積500 μL，做3個(gè)平行對(duì)照，混勻后用紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810DASPC)測(cè)定，分析各種方法所提冠狀散囊菌基因組DNA純度及濃度。A260值代表其濃度，一般OD260/OD280＜1.7，表明樣品中蛋白質(zhì)含量過多;OD260/OD280＞2.0，表明 RNA含量過多;OD260/OD280為1.8表示純度好。

1.3.3 ITS的PCR檢測(cè) 使用50 μL反應(yīng)體系為:10 × buffer(5 μL)、25 mM DNTP(1 μL)10 μM ITS1(3 μL) 、10 μM ITS4(3 μL)、DNA 模板(2 μL)、5 U/μL TaqE(0.2 μL)、DDH2O(35.8 μL);使用的PCR 程序?yàn)?94℃預(yù)變10 min，94℃ 45 s、55℃ 60 s、72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色，點(diǎn)樣2 μL，80 V 恒定電壓 40 min，然后用凝膠成像分析系統(tǒng)(Gellabsystem)拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)冠狀散囊菌基因組DNA

從電泳結(jié)果(圖1)可以看出，各種方法所提冠狀散囊菌基因組DNA分子大小基本一致，說明五種方法均能提取該菌株基因組DNA;十條條帶的亮度都是冠狀散囊菌菌絲體作提取材料的要亮，說明用冠狀散囊菌菌絲體作為材料提取的DNA的收獲量明顯優(yōu)于用子囊孢子;用溶菌酶、纖維素酶、果膠酶提取DNA從瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶上很難發(fā)現(xiàn)有明顯差異說明其破壁能力相差不大;用CTAB法提取該菌株基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度最弱，說明該法說明DNA的收獲率較低，而用SDS法提取該電泳條帶亮度最亮，說明該法說明DNA的收獲率最高，是較為理想的DNA提取方法。

2.2 冠狀散囊菌基因組DNA的濃度、純度比較

用分光光度計(jì)測(cè)定出了各種方法提取的冠狀散囊菌基因組DNA的濃度，通過紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810DASPC)測(cè)定各個(gè)DNA的純度和濃度如表1所示，其中溶菌酶破壁法、纖維素酶破壁法、果膠酶破壁法三種酶破壁法，均以菌絲體基因組DNA的得率較高，其中最高的是溶菌酶，達(dá)到了1.57 mg/mL。CTAB法和SDS法同樣以菌絲體基因組DNA的得率較高，SDS法在所有方法中基因組DNA的得率最高，其中以菌絲體為材料的DNA得率達(dá)到了最高1.69 mg/mL。5種方法所提取的DNA都在OD260處有顯著吸收峰。用子囊孢子為材料提取的基因組 DNA，其 OD260/OD280比值都接近1.8，說明它們的純度都較高，去蛋白和去RNA的效果都較好;用菌絲體為材料提取的基因組DNA，其OD260/OD280比值都小于1.8，且比用子囊孢子的對(duì)應(yīng)方法都要小，說明有菌絲體作為提取基因組DNA的材料，含有一定殘留的蛋白質(zhì)的量較用子囊孢子的要高。其OD260/OD280比值除纖維素酶法外沒有明顯大于1.8的，說明去RNA的效果都較好。為了不影響后續(xù)試驗(yàn)，本研究沒有使用TE緩沖液溶解DNA，而使用了ddH2O。若用TE緩沖液溶解DNA，由于pH值和離子存在會(huì)稍微影響光吸收值，其OD260/OD280比值會(huì)稍高，更接近標(biāo)準(zhǔn)值 1.8［9］。

表1 DNA五種不同提取方法純度和濃度檢測(cè)結(jié)果Table 1 The concentration and purity of Eurotium cristatum DNAs extracted by five methods

2.3 冠狀散囊菌基因組DNA的ITS序列PCR檢測(cè)結(jié)果

使用真菌通用引物ITS 1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')和ITS4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從凝膠電泳結(jié)果(圖2)可以看出，各種方法所提冠狀散囊菌基因組DNA均能擴(kuò)增出長(zhǎng)度為560bp的目的條帶，說明五種方法均能較為完整的提取冠狀散囊菌基因組DNA。

3 討論

文獻(xiàn)檢索表明，溶菌酶破壁法、纖維素酶破壁法、果膠酶破壁法、CTAB法、SDS法均有提取真菌基因組的較為成功的先例，只是未應(yīng)用在冠狀散囊菌中進(jìn)行研究，更未進(jìn)行系統(tǒng)的比較研究，本實(shí)驗(yàn)不但進(jìn)行了這5種方法的比較，而且對(duì)5種方法分別用冠狀散囊菌菌絲體和子囊孢子作為材料，對(duì)比了其提取基因組DNA的效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明能篩選出較為切實(shí)可行的提取方法。

溶菌酶在食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)和酶工程中應(yīng)用十分廣泛［10］。在DNA的提取中主要應(yīng)用在細(xì)菌中進(jìn)行輔助破壁，如金黃色葡萄球［11］、白色瘤胃球菌［12］等。其中三種酶法提取DNA中，溶菌酶破壁法效果較好，其DNA收獲量較其他酶法也稍高，我們認(rèn)為這主要與溶菌酶的作用及特點(diǎn)有關(guān)，溶菌酶以溶解革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁而具有溶菌作用，原因在于它能水解N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸之間的β-1.4糖苷鍵。溶菌酶發(fā)揮溶菌作用的最適酸度在 pH 8.0 左右，溶菌酶在 pH 1.2 ～11.3 的廣泛范圍內(nèi)劇烈變化時(shí)都沒有發(fā)現(xiàn)溶菌酶活性任何改變，因此溶菌酶對(duì)酸堿度的變化不敏感。在堿性范圍時(shí)，穩(wěn)定性較差。溶菌酶的熱變性是可逆的，其變性溫度一般不高于70℃，溶菌酶是相當(dāng)穩(wěn)定的［13］。但冠狀散囊菌是真菌，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陰性細(xì)菌顯著不同，從試驗(yàn)結(jié)果看，其DNA收獲量遠(yuǎn)較SDS法的低，很可能是溶菌酶裂解法不能使真菌細(xì)胞壁裂解充分，基因組DNA釋放不充分，同時(shí)也導(dǎo)致去除蛋白質(zhì)及苯酚不徹底。

纖維素酶由多種水解酶組成的一個(gè)復(fù)雜酶系，自然界中很多真菌都能分泌纖維素酶。習(xí)慣上，將纖維素酶分成三類:C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶。C1酶是對(duì)纖維素最初起作用的酶，破壞纖維素鏈的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。Cx酶是作用于經(jīng)C1酶活化的纖維素、分解β-1，4-糖苷鍵的纖維素酶。β葡糖苷酶可以將纖維二糖、纖維三糖及其他低分子纖維糊精分解為葡萄糖［14，15］。其纖維素酶對(duì)底物的最適作用溫度為45℃，最適 pH 值為 4.5 － 5.0［16］。纖維素酶在環(huán)境、藥品、食品、飼料、釀酒、洗滌劑工業(yè)和石油開采等方面都有很好的應(yīng)用［16］，纖維素酶預(yù)處理能明顯提高植物的破壁效果［17，18］。

果膠酶是分解果膠的一個(gè)多酶復(fù)合物，通常包括原果膠酶、果膠甲酯水解酶、果膠酸酶。通過它們的聯(lián)合作用使果膠質(zhì)得以完全分解。天然的果膠質(zhì)在原果膠酶作用下，轉(zhuǎn)化成水可溶性的果膠;果膠被果膠甲酯水解酶催化去掉甲酯基團(tuán)，生成果膠酸;果膠酸經(jīng)果膠酸水解酶類和果膠酸裂合酶類降解生成半乳糖醛酸。但作用pH 2.5－6.0較為窄，且最適作用pH 3.5，作用溫度為15～55℃左右。最適作用溫度為50℃。目前果膠酶在食品、紡織、醫(yī)藥、造紙、環(huán)境、生物技術(shù)、飼料等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［19］。

我們用上述溶菌酶、纖維素酶、果膠酶三種酶都能有效提取真菌DNA，且其提取效果有一定的差異，但差異不大，我們認(rèn)為這三種酶各自的優(yōu)化作用條件應(yīng)該有差異，但我們統(tǒng)一用一種條件進(jìn)行裂解，顯然不能說明三種酶的作用全貌，相對(duì)來講溶菌酶的稍好，可能是該酶的適應(yīng)pH值相對(duì)較廣，而纖維素酶、果膠酶屬于酸性適應(yīng)裂解酶。

CTAB法主要用于植物DNA的提?。?0］以真菌菌絲體為材料的DNA提取也有一些成功報(bào)道［21－24］，但提取質(zhì)量亟待改善，主要原因是真菌多糖、多酚等次生物質(zhì)的存在使提取的真菌DNA中總殘留多糖雜質(zhì)，由于其許多理化性質(zhì)與核酸很相似，因此很難將它們分開。多糖的污染，不僅使DNA定量不準(zhǔn)，還直接影響下游反應(yīng)酶的活性［25］。正因此很多學(xué)者在運(yùn)用該法時(shí)往往加以改進(jìn)，如楊同文等［26］采用CTAB結(jié)合DNA凝膠回收試劑盒提取食用菌DNA來除去雜質(zhì)污染。我們的實(shí)驗(yàn)證明CTAB法提取冠狀散囊菌基因組DNA在五種方法中效果確實(shí)是最差的，說明其提取方法還有待優(yōu)化和改進(jìn)。

SDS法廣泛用于植物、動(dòng)物、微生物的DNA提?。?7－29］，其中特別是對(duì)多糖含量豐富的植物效果尤為明顯，如李靜等對(duì)石斛基因組DNA研究［30］，本研究證實(shí)對(duì)冠狀散囊菌基因組DNA提取效果是最好的，不但DNA收獲率較高，而且其紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810DASPC)DNA的純度檢測(cè)也證實(shí)其純度較其他方法的好。

本實(shí)驗(yàn)中，所用的材料冠狀散囊菌菌絲體和子囊孢子，五種方法在提取DNA時(shí)也表現(xiàn)出一定的差異，但都證實(shí)用冠狀散囊菌菌絲體作為DNA提取材料優(yōu)于用子囊孢子。具體體現(xiàn)在DNA的收獲量、純度上(見表1)，筆者認(rèn)為，導(dǎo)致該差異出現(xiàn)的主要原因是冠狀散囊菌菌絲體細(xì)胞壁和子囊孢子子囊壁的結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致，冠狀散囊菌菌絲體提取效果普遍優(yōu)于對(duì)應(yīng)的子囊孢子，說明菌絲體結(jié)構(gòu)上更容易破壁而釋放基因組DNA。另外DNA的存在環(huán)境致使細(xì)胞多糖、多酚等非DNA組分影響其DNA提取也是不可忽視的一個(gè)重要因素，很顯然，相關(guān)的研究尚需進(jìn)一步的深入。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合成本因素我們建議用冠狀散囊菌菌絲體作為材料，采用SDS法進(jìn)行基因組DNA提取，能穩(wěn)定獲得含蛋白質(zhì)少、降解不明顯、產(chǎn)量較高的基因組DNA。

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