王賢波 崔紅春 黃海濤

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310024)

茶葉中兒茶素(catechin)是茶葉中重要的一類天然活性物質(zhì)，是天然的抗氧化劑和自由基清除劑，被廣泛的應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域［1，2，3］。兒茶素占茶葉中茶多酚總量的60% ～80%，主要有表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)及表兒茶素(EC)等［3，4］。大量實(shí)驗(yàn)已證明兒茶素具有抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基、壓制黑色素合成等作用［2］。有研究表明 EGC的抗氧化能力僅次于EGCG［5］。因此，EGC 的提取制備研究具有重要意義。

響應(yīng)面方法(Response Surface Methodology，RSM)是20世紀(jì)中后葉發(fā)展起來(lái)的優(yōu)化試驗(yàn)條件統(tǒng)計(jì)學(xué)方法［6］，利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，它可快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，它已成為精度高、應(yīng)用廣并具有實(shí)用價(jià)值的優(yōu)化技術(shù)［7］，因此被廣泛地應(yīng)用于條件優(yōu)化和模型建立中。

本文用去離子水浸提茶葉中的EGC，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)EGC的浸提條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳浸提條件，為后期提純提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

茶葉:采自余杭徑山茶園。

1.2 主要儀器和試劑

高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，電子天平(METTLER公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)。

甲酸、乙腈為色譜純，EGC標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 茶葉中EGC浸提 茶葉過(guò)20目篩，用去離子水浸提，稱取50 g綠茶粉末于燒杯中，加入一定量去離子水，在恒溫水浴鍋中于一定溫度下浸提一定時(shí)間后，過(guò)濾，得茶多酚浸提液，用高效液相色譜法檢測(cè)EGC含量。

1.3.2 EGC浸出率的測(cè)定 取 EGC標(biāo)準(zhǔn)樣用HPLC法測(cè)定濃度－峰面積標(biāo)準(zhǔn)線性方程如下:

式中，Y為峰面積(μV·S);X為EGC的質(zhì)量濃度 (mg/L);方程的線性相關(guān)系數(shù)為0.9998679;色譜條件:以0.5%的甲酸和乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流速為1 mL/min。

EGC浸出率由下式計(jì)算:

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取50 g綠茶粉末于燒杯中，按照1∶12料液比加入600 mL去離子水，浸提1次，pH 6.0，在恒溫水浴鍋中于80℃下浸提不同時(shí)間，過(guò)濾，得茶多酚浸提液，用高效液相色譜法檢測(cè)EGC含量，計(jì)算EGC浸出率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 浸提時(shí)間對(duì)EGC浸出率的影響

取50 g綠茶粉末于燒杯中，按照1∶12料液比加入600 mL去離子水，浸提1次，pH 6.0，在不同溫度下浸提20 min，過(guò)濾，得茶多酚浸提液，用高效液相色譜法檢測(cè)EGC含量，計(jì)算EGC浸出率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

取50 g綠茶粉末于燒杯中，浸提1次，pH 6.0，在80℃下浸提20 min，按照不同料液比進(jìn)行浸提，過(guò)濾，得茶多酚浸提液，用高效液相色譜法檢測(cè)EGC含量，計(jì)算EGC浸出率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

取50 g綠茶粉末于燒杯中，按照1∶12料液比，浸提1次，在80℃下浸提20 min，在不同pH值下浸提，過(guò)濾，得茶多酚浸提液，用高效液相色譜法檢測(cè)EGC含量，計(jì)算EGC浸出率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 浸提pH對(duì)EGC浸出率的影響

取50 g綠茶粉末于燒杯中，按照1∶12料液比加入600 mL去離子水，pH 6.0，在80℃下浸提20 min，浸提不同次數(shù)，過(guò)濾，得茶多酚浸提液，用高效液相色譜法檢測(cè)EGC含量，計(jì)算EGC浸出率，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖1可知，在20分鐘時(shí)EGC浸出率最大，之后逐漸下降，可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，EGC發(fā)生了異構(gòu)反應(yīng)。由圖2可知，隨著溫度升高，EGC浸出率先升高后降低，這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高EGC變得不穩(wěn)定，發(fā)生了異構(gòu)反應(yīng)。由圖3可知，隨著料液比的增加，EGC浸出率隨之增加，但是1∶12之后變化不明顯，而且隨著溶劑的增加會(huì)給后續(xù)處理帶來(lái)麻煩，所以料液比不宜過(guò)大，本實(shí)驗(yàn)選擇料液比為1∶12。由圖4可知，EGC的浸出率隨著pH值的升高先變大后降低，在酸性環(huán)境中可能是沒(méi)食子基團(tuán)在起作用，容易與酸結(jié)合，導(dǎo)致游離的EGC減少［8］，pH值升高可能引起EGC氧化。由圖5可知，EGC浸出率隨著次數(shù)的增加而增加，但從浸提2次以后浸出率的變化不明顯。

圖5 浸提次數(shù)對(duì)EGC浸出率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化EGC的浸提條件

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在選定料液比為1∶12，浸提2次的前提下，采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，包括12個(gè)析因?qū)嶒?yàn)和3個(gè)中心實(shí)驗(yàn)。以浸提溫度，浸提時(shí)間，pH為自變量，以EGC浸出率為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)因素與水平的選取見(jiàn)表1，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素與水平取值表

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用統(tǒng)計(jì)軟件MINITAB15對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，然后對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

利用MINITAB15回歸擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，獲得EGC浸出率對(duì)浸提溫度，浸提時(shí)間，pH的三元二次回歸方程:Y=1.93333 －0.06A －0.0425B+0.0625C －0.15917A2－ 0.11417B2－ 0.19417C2－ 0.01AB －0.02AC+0.025BC。由回歸方程的方差分析結(jié)果(表3)可以看出，該模型失擬不顯著，回歸顯著。另外該模型決定系數(shù)R2=0.9761，說(shuō)明回歸方程的擬合程度較好，預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性，因此該模型可以應(yīng)用于EGC浸出率的理論預(yù)測(cè)。EGC浸出率響應(yīng)面分析關(guān)鍵點(diǎn)值見(jiàn)表4。

表3 回歸方程的方差分析

表4 EGC浸出率響應(yīng)面分析關(guān)鍵點(diǎn)值

由表4可知，該回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，EGC浸出率的最大估計(jì)值1.9475%，3個(gè)因素取值分別為:浸提溫度78.0808℃、時(shí)間18.4848 min、pH 6.1515。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為計(jì)算方便各因素取整數(shù)得到 EGC 浸提優(yōu)化條件:料液比 1∶12、pH 6.2、溫度78℃、時(shí)間 18 min、浸提 2次。圖 6－8為通過(guò)MINITAB15得到的響應(yīng)面分析圖及其等高線圖，每個(gè)響應(yīng)面分別代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，由響應(yīng)面圖可以看出:浸提溫度、浸提時(shí)間、pH與EGC浸出率存在相關(guān)性。利用得到的優(yōu)化條件進(jìn)行浸提驗(yàn)證，得到EGC浸出率為2.0%，說(shuō)明該模型可以應(yīng)用于EGC浸出率的預(yù)測(cè)。

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)用去離子水浸提茶葉中的EGC，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)EGC的浸提條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳浸提條件:料液比1∶12、pH 6.2、溫度78℃、時(shí)間18 min、浸提2次。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，該模型可以應(yīng)用于EGC浸出率的預(yù)測(cè)。

1 劉學(xué)銘，梁世中.茶多酚的保健和藥理作用及應(yīng)用前景.食品與發(fā)酵工業(yè)，1998，24(5):47 －51，71.

2 趙麗萍，邵宛芳.茶葉中EGCG功效研究進(jìn)展.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23(7):143 －147.

3 焦蓓蓓.茶多酚的藥理作用研究進(jìn)展.亞太傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，2009，5(1):131－133.

4 劉世初，孫志洪，王 斌.茶多酚的提取工藝及其應(yīng)用機(jī)理研究進(jìn)展.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，30(4):91 －94.

5 高永貴，楊賢強(qiáng)，周樹(shù)紅.試論茶多酚清除自由基的高效性.天然產(chǎn)物與研究開(kāi)發(fā)，1999，11(2):82 －86.

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7 慕運(yùn)動(dòng).響應(yīng)面方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用.鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，22(3):91 －94.

8 陳利燕，屠幼英，陳暄等.兒茶素在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性研究.茶葉，2002，28(2):86 －88.